用噻唑橙代替溴代或替代染料进行 DNA 电泳
Summary
在这里, 我们提出了一个协议, 使用噻唑橙检测 DNA 的凝胶电泳实验。使用噻唑橙可以消除溴化乙酯, 并且可以使用紫外或蓝光进行荧光检测。
Abstract
使用琼脂糖进行 DNA 凝胶电泳是分子生物学实验室中常见的工具, 可以按大小分离 DNA 片段。分离后, DNA 通过染色进行可视化。这篇文章演示如何使用噻唑橙染色 DNA。与普通染色方法相比, 噻唑橙与普通染色方法相比是有利的, 因为它敏感、价格低廉、可与紫外线或蓝光激发 (以防止样品损坏), 并且比溴化乙酯更安全。已经配备了使用溴化乙酯进行 DNA 电泳实验的实验室通常可以在不对现有协议作额外修改的情况下切换染料, 使用紫外线进行检测。蓝光检测, 以避免样品损坏, 还可以实现与蓝光源和发射过滤器。已经配备了蓝光检测设备的实验室可以简单地切换染料, 而无需对现有协议进行其他更改。
Introduction
该方法的目的是利用噻唑橙 (TO) 进行荧光检测, 以确定琼脂糖凝胶中的 DNA。由于其低成本和良好的安全性能, 噻唑橙可能会在从事分子生物学, 特别是结扎和克隆的本科教学实验室和研究实验室中看到特别的好处。
溴化乙酯仍然是检测琼脂糖凝胶中 DNA 的最常见染料。这主要是因为它可以非常便宜地获得, 只需要用紫外线进行激发进行检测。溴化乙酯和噻唑橙价格低廉, 检出限低 (1-2 ng/lane)1。有两个主要的缺点, 乙二酸溴, 然而, 噻唑橙改善。
首先, 溴化乙酯是一种具有特殊处理、运输和处置要求的突变体2 , 而噻唑橙剂的致突变性较低 (在艾姆斯试验中3–4x 较少致突变性)3、4, 一般可以用常见的化学废物。
其次, 溴化物需要紫外线进行检测。如果需要, 噻唑橙同样可以使用紫外线, 但也可以用蓝光检测。紫外线虽然使用广泛, 但也有一些明显的缺点。首先, 它损害了人体的皮肤和眼睛。虽然紫外线可以由训练有素的专业人员安全使用, 但实验室紫外线对皮肤或眼睛的意外损害 (功能类似于晒伤) 并不少见, 尤其是在经验不足的科学家中。其次, 紫外线对 dna 样本5的危害极大, 这降低了下游实验 (如结扎和转化)1,6,7的成功。允许用蓝光进行探测 (ex, max = 510 nm (488 nm 和 470 nm 也显示出强烈的激发)), 不会造成皮肤损伤或 dna 损伤 (尽管任何强光可能仍然对眼睛有害), 大大降低了科学家面临的风险和样品。
TO 并不是溴化乙酯的唯一荧光染料替代品;它的优势在于成本。to 在20世纪80年代被发现为网状细胞染色8, 并已在一些基于 dna 的荧光实验9,10,11, 12,13中发现了有用的。它目前由多个供应商出售。TO 是额外的、更昂贵的蓝光–可检测到的商业染料的父化合物, 在电泳过程中表现类似, 使用紫外线或蓝光进行检测1。此外, 虽然其他染料对 Dna 浓度比 EtBr 或 TO 更敏感, 但对于一般电泳实验, 此类染料在许多情况下的成本高得令人望而却步。
Protocol
Representative Results
Discussion
尽管已知毒性, 但溴化乙酯长期以来一直是分子生物学实验室的标准工具。它还受到需要紫外线的影响, 紫外线会在检测到 DNA 时对其造成损害。噻唑橙提供了一种廉价的替代溴化乙酯, 以及有用但昂贵的商业染料。
因此, 噻唑橙的好处是双重的。首先, 噻唑橙可以简单地作为溴化乙酯的替代品。凝胶的制备可以与 EtBr 相同, 用 TO 代替为污渍 (步骤 1.2)。检测极限相似 (~ 1-2 ng/车?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了克里斯托弗·纽波特大学 TDG 创业基金的支持。
Materials
| 2-log DNA ladder | New England Biolabs | N0469S | |
| Agarose (Genetic Analysis Grade) | Fisher | BP1356-100 | |
| Blue-light flashlight | WAYLLSHINE (Amazon) | WAYLLSHINE Scalable Blue LED | |
| ChemiDoc MP | Biorad | 1708280 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| ethidium bromide | Fisher | BP1302-10 | For comparison, not necessary for protocol |
| Gel apparatus (Owl Easy Cast) | Thermo Scientific | B1A | |
| Qiagen Qiaquick Gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Safe Imager Viewing Glasses | Invitrogen | S37103 | Necessary for using blue light flashlight.* |
| SafeImager 2.0 (Blue light transilluminator) | Invitrogen | G6600 | Blue light flashlight may be used as alternative |
| SYBR Safe | Invitrogen | S33102 | For comparison, not necessary for protocol |
| TAE (Tris-Acetate-EDTA) | Corning | 46-010-CM | |
| Thiazole orange | Sigma-Aldrich | 390062 | |
| *Glasses are also included with Invitrogen G6600 |
References
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