DNA elektroforese ved hjælp af Thiazole Orange i stedet for ethidiumbromid eller Alternative farvestoffer
Summary
Vi præsenterer her, en protokol for at bruge thiazole orange til påvisning af DNA i gel elektroforese eksperimenter. Brug af thiazole orange tillader eliminering af ethidiumbromid, og registrering af fluorescens kan opnås med UV eller blåt lys.
Abstract
DNA gelelektroforese bruger Agarosen er et fælles redskab i molekylærbiologiske laboratorier, giver mulighed for adskillelse af DNA fragmenter efter størrelse. Efter adskillelse, er DNA visualiseres ved farvning. Denne artikel viser, hvordan man bruger thiazole orange at plette DNA. Thiazole orange sammenligner positivt til fælles farvning metoder, der er følsomme, billig, overgearet med UV eller blåt lys (for at forhindre prøve skader) og sikrere end ethidiumbromid. Labs allerede udstyret til kører DNA elektroforese eksperimenter ved hjælp af ethidiumbromid kan generelt skifte farvestoffer uden yderligere ændringer til eksisterende protokoller, ved hjælp af UV-lys til påvisning. Blåt-lys registrering for at undgå beskadigelse af prøven kan desuden opnås med et blåt-lys kilde og emission filter. Labs allerede udstyret til registrering af blåt-lys kan ganske enkelt skifte farvestoffer uden yderligere ændringer til eksisterende protokoller.
Introduction
Formålet med denne metode er at identificere DNA i agarosegelitris ved hjælp af thiazole orange (at) til registrering af fluorescens. På grund af sin lave omkostninger og gunstige sikkerhedsprofil, kan thiazole orange Se særlig gavn i undergraduate undervisning labs og forskning labs udfører Molekylærbiologi, især ligations og kloning.
Ethidiumbromid er stadig den mest almindelige farvestof til påvisning af DNA i agarosegelitris. Dette er primært fordi det kan fås meget billigt og kræver kun excitation med UV-lys til påvisning. Begge ethidium bromid og thiazole orange er billig, med lav afsløring grænser (1-2 ng/lane)1. Der er to vigtigste ulemper til ethidiumbromid, dog at thiazole orange forbedrer.
Først, ethidiumbromid er en mutagen2 med speciel håndtering, forsendelse og bortskaffelse krav, mens thiazole orange er mindre mutagene (3 – 4 x mindre mutagene i Ames test)3,4 og kan være generelt bortskaffes med fælles kemisk affald.
For det andet kræver ethidiumbromid UV-lys til påvisning. Thiazole orange kan ligeledes bruge UV lys hvis det ønskes, men kan også påvises med blåt lys. UV-lys, har mens almindeligt anvendt, et par iøjnefaldende ulemper. Først, det er skadeligt på menneskers hud og øjne. Mens UV-lys kan anvendes sikkert af uddannede fagfolk, tilfældig hud eller øje skade (funktionelt svarer til solforbrændinger) fra laboratorium UV lys er ikke ualmindelige især med uerfarne forskere. Andet, UV-lys yderst skadelig for DNA prøver5, hvilket reducerer succesen af downstream eksperimenter (f.eks ligatur og transformation)1,6,7. TIL tillader detektering med blåt lys (λex, max = 510 nm (488 nm og 470 nm viser også stærk excitation)), som ikke forårsager hudskader eller DNA skade (selv om nogen intense lys kan stadig være skadelige for øjnene), stærkt faldende risici til begge videnskabsmand og prøven.
AT er ikke kun fluorescerende farvestof alternativ til ethidiumbromid; dens fordel er omkostningerne. AT blev opdaget i 1980 ‘ erne som en reticulocyte plet8, og har fundet nytte i en række DNA-baserede fluorescens eksperimenter9,10,11,12,13. Det er i øjeblikket sælges af flere leverandører. TIL er moderselskabet sammensatte af yderligere, mere dyrt, blåt-lys-påviselige kommercielle farvestoffer, og opfører sig på samme måde under elektroforese, ved hjælp af UV- eller blåt lys for registrering af1. Endvidere, mens andre farvestoffer er mere følsomme overfor meget lave DNA koncentrationer end enten EtBr eller TO, for generiske elektroforese eksperimenter, disse farvestoffer er uoverkommeligt dyre i mange sammenhænge.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ethidiumbromid har længe været et standard værktøj i molekylær biologi lab, trods kendt toksicitet. Det lider også af kræver UV lys, som skader DNA, som det er at blive opdaget. Thiazole orange tilbyder et billigt alternativ til ethidiumbromid, såvel som nyttige, men dyre kommercielle farvestoffer.
Fordelene ved thiazole orange er dermed to gange. Thiazole orange kan først, blot bruges som en erstatning for ethidiumbromid. Gels kan tilberedes identisk til EtBr, med til stedet som plet…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af startup midler til TDG fra Christopher Newport Universitet.
Materials
| 2-log DNA ladder | New England Biolabs | N0469S | |
| Agarose (Genetic Analysis Grade) | Fisher | BP1356-100 | |
| Blue-light flashlight | WAYLLSHINE (Amazon) | WAYLLSHINE Scalable Blue LED | |
| ChemiDoc MP | Biorad | 1708280 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| ethidium bromide | Fisher | BP1302-10 | For comparison, not necessary for protocol |
| Gel apparatus (Owl Easy Cast) | Thermo Scientific | B1A | |
| Qiagen Qiaquick Gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Safe Imager Viewing Glasses | Invitrogen | S37103 | Necessary for using blue light flashlight.* |
| SafeImager 2.0 (Blue light transilluminator) | Invitrogen | G6600 | Blue light flashlight may be used as alternative |
| SYBR Safe | Invitrogen | S33102 | For comparison, not necessary for protocol |
| TAE (Tris-Acetate-EDTA) | Corning | 46-010-CM | |
| Thiazole orange | Sigma-Aldrich | 390062 | |
| *Glasses are also included with Invitrogen G6600 |
References
- O’Neil, C. S., Beach, J. L., Gruber, T. D. Thiazole orange as an everyday replacement for ethidium bromide and costly DNA dyes for electrophoresis. Electrophoresis. 39 (12), 1474-1477 (2018).
- McCann, J., Choi, E., Yamasaki, E., Ames, B. N. Detection of carcinogens as mutagens in the Salmonella/microsome test: assay of 300 chemicals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (12), 5135-5139 (1975).
- Evenson, W. E., Boden, L. M., Muzikar, K. A., O’Leary, D. J. 1H and 13C NMR Assignments for the Cyanine Dyes SYBR Safe and Thiazole Orange. The Journal of Organic Chemistry. 77 (23), 10967-10971 (2012).
- Beaudet, M., Cox, G., Yue, S. . Molecular Probes, Inc. , (2005).
- Pfeifer, G. P., You, Y. H., Besaratinia, A. Mutations induced by ultraviolet light. Mutation Research. 571 (1-2), 19-31 (2005).
- Cariello, N. F., Keohavong, P., Sanderson, B. J., Thilly, W. G. DNA damage produced by ethidium bromide staining and exposure to ultraviolet light. Nucleic Acids Research. 16 (9), 4157 (1988).
- Hartman, P. S. Transillumination can profoundly reduce transformation frequencies. BioTechniques. 11 (6), 747-748 (1991).
- Lee, L. G., Chen, C. H., Chiu, L. A. Thiazole orange: a new dye for reticulocyte analysis. Cytometry. 7 (6), 508-517 (1986).
- Nygren, J., Svanvik, N., Kubista, M. The Interactions Between the Fluorescent Dye Thiazole Orange and DNA. Biopolymers. , 1-13 (1998).
- Svanvik, N., Westman, G., Wang, D., Kubista, M. Light-Up Probes: Thiazole Orange-Conjugated Peptide Nucleic Acid for Detection of Target Nucleic Acid in Homogeneous Solution. Analytical Biochemistry. 281 (1), 26-35 (2000).
- Yang, P., De Cian, A., Teulade-Fichou, M. P., Mergny, J. L., Monchaud, D. Engineering Bisquinolinium/Thiazole Orange Conjugates for Fluorescent Sensing of G-Quadruplex DNA. Angewandte Chemie International Edition. 48 (12), 2188-2191 (2009).
- Fang, G. M., Chamiolo, J., Kankowski, S., Hovelmann, F., Friedrich, D., Lower, A., Meier, J. C., Seitz, O. A bright FIT-PNA hybridization probe for the hybridization state specific analysis of a C → U RNA edit via FRET in a binary system. Chemical Science. 9 (21), 4794-4800 (2018).
- Pei, R., Rothman, J., Xie, Y., Stojanovic, M. N. Light-up properties of complexes between thiazole orange-small molecule conjugates and aptamers. Nucleic Acids Research. 37 (8), e59-e59 (2009).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), 1-5 (2012).
- Vogelstein, B., Gillespie, D. Preparative and analytical purification of DNA from agarose. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 615-619 (1979).
