Ethidium 평범한 사람 또는 대체 염료 대신 Thiazole 오렌지를 사용 하 여 DNA 전기 이동 법
Summary
여기, 선물이 젤 전기 이동 법 실험에서 DNA의 검출을 위한 thiazole 오렌지를 사용 하는 프로토콜. Thiazole 오렌지의 사용 ethidium 평범한 사람의 제거를 허용 하 고 형광 탐지 UV 또는 푸른 빛으로 달성 될 수 있다.
Abstract
DNA 젤 전기 이동 법은 agarose를 사용 하 여 크기에 의해 DNA 파편의 분리를 수 분자 생물학 실험실에서 일반적인 도구입니다. 분리 후 DNA 얼룩에 의해 시각 이다. 이 문서에서는 thiazole 주황색 얼룩을 DNA를 사용 하는 방법을 보여 줍니다. Thiazole 오렌지 비교 호의 일반적인 착 방법, 그것은, 저렴 한, UV 또는 파란 빛 (손상을 방지 하기 위해 샘플), 고르기 민감하고 ethidium 평범한 사람 보다 안전 합니다. 이미 DNA 전기 영동 실험 ethidium 평범한 사람을 사용 하 여 실행을 갖추고 실험실 일반적으로 자외선을 사용 하 여 검색에 대 한 기존 프로토콜을 추가 변경 없이 염료를 전환할 수 있습니다. 블루 빛 감지 샘플의 손상을 방지 하려면 블루 빛 소스와 배출 필터 또한 얻을 수 있습니다. 이미 블루 빛 감지 장비 실험실 단순히 기존 프로토콜 추가 변경 없이 염료를 전환할 수 있습니다.
Introduction
이 방법의 목적은 agarose 젤 형광 탐지 thiazole 오렌지 (을)를 사용 하 여 DNA를 식별 하는 것입니다. 그것의 저가 및 유리한 안전 프로필로 인해 thiazole 오렌지 학부 교육 연구소 및 분자 생물학, 특히 ligations 및 복제를 수행 하는 연구 실험실에서 특정 혜택을 볼 수 있습니다.
Ethidium 평범한 사람 agarose 젤에서 DNA의 검출에 대 한 가장 일반적인 염료 남아 있습니다. 이 매우 저렴 하 게 얻을 수 있습니다 때문에 주로 하며만 자외선과 여기 검색. 두 ethidium 평범한 사람 및 thiazole 오렌지 낮은 검출 한계 (1-2 ng/레인)1비싼 되지 않습니다. 그러나 Thiazole 오렌지 시 향상 ethidium 평범한 사람,,에 두 가지 주요 단점이 있다.
첫째, ethidium 평범한 사람은 특수 처리, 운송, 및 처리 요구 사항, 돌연2 thiazole 오렌지는 덜 돌연변이 (3-4 x 덜 Ames 시험에서 변이 원 성)3,4 와 일반적으로 삭제 될 수 있습니다 일반적인 화학 폐기물입니다.
둘째, ethidium 평범한 사람 검색 UV를 빛을 필요합니다. Thiazole 오렌지 바란다면, UV 빛 마찬가지로 사용할 수 있습니다 하지만 또한 푸른 빛으로 검출 될 수 있습니다. UV 빛, 일반적으로 사용 되는 몇 가지 두드러진 단점이 있습니다. 첫째, 그것은 인간의 피부와 눈에 손상 이다. UV 빛은 숙련 된 전문가 의해 안전 하 게 사용할 수 있습니다, 하는 동안 사고 피부 또는 눈 손상 (기능적으로 비슷합니다 sunburns) 실험실 UV 빛에서 미숙한 과학자와 특히 흔히 되지 않습니다. 둘째, 자외선은 DNA 샘플5, (결 찰 및 변환) 등 다운스트림 실험1,,67의 성공을 감소 시키는 매우 파괴적 이다. TO 있습니다 푸른 빛으로 감지 (λ전, 최대 510 = nm (488 nm 및 470 nm도 강한 흥분을 표시))는 피부 손상의 원인이 되지 않습니다, 또는 DNA 손상 (하지만 어떤 강렬한 빛은 여전히 눈에 해로울 수 있습니다), 두 과학자를 위험을 크게 감소 그리고 샘플입니다.
아니다 ethidium 평범한 사람;에 형광 염료 대안 그것의 이점은 비용입니다. Reticulocyte 얼룩8, 1980 년대에서 발견 되었다 및 다양 한 형광 DNA 기반 실험9,10,11,,1213에 유틸리티를 발견 했다. 그것은 현재 여러 공급 업체에 의해 판매 됩니다. 추가 하 고, 더 비싼의 부모 화합물, 파랑-빛-감지 상업 염료 이며 탐지1UV 또는 푸른 빛을 사용 하 여 전기 이동 법 동안 유사 하 게 동작. 또한, 다른 염료 보다 더 민감한 DNA 농도 매우 낮은 EtBr 또는, 일반 전기 실험에 대 한 동안, 같은 염료는 많은 상황에서 엄청나게 비싸다.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ethidium 평범한 사람은 오랫동안 알려진된 독성에도 불구 하 고 분자 생물학 실험실에서 표준 도구. 그것은 또한 요구로 감지 되 고 DNA를 손상 자외선에서 겪고 있다. Thiazole 오렌지 ethidium 평범한 사람 뿐만 아니라 유용 하지만 비싼 상업용 염료는 저렴 한 대안을 제공합니다.
Thiazole 오렌지의 혜택은 따라서 두 배. 첫째, thiazole 오렌지 ethidium 평범한 사람을 교체로 간단 하 게 사?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 크리스토퍼 뉴포트 대학에서 TDG에 시작 기금에 의해 지원 되었다.
Materials
| 2-log DNA ladder | New England Biolabs | N0469S | |
| Agarose (Genetic Analysis Grade) | Fisher | BP1356-100 | |
| Blue-light flashlight | WAYLLSHINE (Amazon) | WAYLLSHINE Scalable Blue LED | |
| ChemiDoc MP | Biorad | 1708280 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| ethidium bromide | Fisher | BP1302-10 | For comparison, not necessary for protocol |
| Gel apparatus (Owl Easy Cast) | Thermo Scientific | B1A | |
| Qiagen Qiaquick Gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Safe Imager Viewing Glasses | Invitrogen | S37103 | Necessary for using blue light flashlight.* |
| SafeImager 2.0 (Blue light transilluminator) | Invitrogen | G6600 | Blue light flashlight may be used as alternative |
| SYBR Safe | Invitrogen | S33102 | For comparison, not necessary for protocol |
| TAE (Tris-Acetate-EDTA) | Corning | 46-010-CM | |
| Thiazole orange | Sigma-Aldrich | 390062 | |
| *Glasses are also included with Invitrogen G6600 |
References
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