Isolasjon og farging av mus Skin keratinocytter for celle syklus spesifikk analyse av Cellular protein uttrykk ved Mass flowcytometri
Summary
Denne protokollen beskriver hvordan å isolere huden keratinocytter fra musemodeller, å beis med metall-kodede antistoffer, og å analysere fargede celler ved masse flowcytometri for å profilen uttrykket mønster av proteiner av interesse i de ulike celle syklus faser.
Abstract
Målet med denne protokollen er å oppdage og kvantifisere protein uttrykk endringer i en celle syklus avhengig måte ved hjelp av enkeltceller isolert fra epidermis av musen huden. Det er sju viktige trinn: separasjon av epidermis fra dermis, fordøyelse av epidermis, farging av epidermal celle populasjoner med Cisplatin, sample barcoding, farging med metall merket antistoffer for celle syklus markører og proteiner av interesse, påvisning av metall-kodede antistoffer av masse flowcytometri, og analysen av uttrykket i de ulike celle syklus faser. Fordelen med denne tilnærmingen over histologiske metoder er potensialet til analysen uttrykket mønster av > 40 forskjellige markører i en enkelt celle i ulike faser av celle syklus. Denne tilnærmingen gir også mulighet for multivariabel korrelasjon analyse av protein uttrykk som er mer målbare enn histologiske/Imaging metoder. Ulempen med denne protokollen er at en suspensjon av enkeltceller er nødvendig, noe som resulterer i tap av stedsinformasjon gitt av farging av vev seksjoner. Denne tilnærmingen kan også kreve inkludering av ekstra markører for å identifisere ulike celletyper i råolje celle suspensjoner. Anvendelsen av denne protokollen er tydelig i analysen av hyperplastisk hudsykdom modeller. Videre kan denne protokollen tilpasses for analyse av spesifikke under type celler (for eksempel stamceller) ved tilsetning av avstamning-spesifikke antistoffer. Denne protokollen kan også tilpasses for analyse av hudceller i andre eksperimentelle arter.
Introduction
Korrelasjon av genuttrykk med celle syklus stadier er fortsatt en utfordring i analysen av dyremodeller av hyperplastisk sykdommer som kreft. En del av denne utfordringen er co-deteksjon av proteiner av interesse (POI) med markører for spredning. Proliferativ celler kan finnes i ulike celle syklus faser inkludert G1, S, G2, og M. Ki67 er en av de mest brukte markører for spredning og uttrykkes i alle faser av cellesyklusen. Det har vært mye brukt i analysen av både menneskelig og mus vev1,2,3. Men som andre generelle spredning markører, Ki67 ikke skjelne enkelte celle syklus faser. En mer presis tilnærming bruker inkorporering av tymidin nukleotid analogs som Bromodeoxyuridine (BrdU) i celler som er aktivt replikere sine Genova (dvs. S-fase)4,5. En ulempe for bruk av nukleotid analogs er behovet for å administrere dem til å leve dyr timer før analyse. Ki67 og BrdU blir ofte oppdaget på faste vevs deler ved bruk av antistoffer. En fordel med denne tilnærmingen er at plasseringen av POI kan fastslås innenfor vev arkitekturen (f. eks basal laget av huden epidermis). Denne tilnærmingen krever heller ikke vevs dissosiasjon som kan føre til endringer i genuttrykk. En ulempe er at vevet fiksering eller behandling av vev for OCT frosset eller para fin snitting kan tette antistoff mål (dvs. antigener). Henting av antigener krever vanligvis varme eller vevs fordøyelsen. Kvantifisering av farge intensitet kan også være utfordrende. Dette skyldes variasjoner i farging, snitt tykkelse, signal deteksjon og eksperimentator bias. Videre kan et begrenset antall markører oppdages samtidig i de fleste typiske laboratorie oppsett. Likevel, nyere multiplex flekker tilnærminger lover å overvinne disse begrensningene; Eksempler er Imaging Mass flowcytometri og Tyramide signal forsterkning6,7.
Flow flowcytometri er en annen kraftig teknologi for å oppdage voksende celler. Det gjør det mulig for multiplex deteksjon av markører i de samme cellene, men krever vev dissosiasjon for de fleste ikke-blodkreft celletyper. Analyse av voksende celler blir rutinemessig gjort ved bruk av fargestoffer som binder DNA (f. eks, Propidium iodide (PI))8. Flow flowcytometri tillater også en mer presis bestemmelse av celle syklus faser når kombinert med påvisning av BrdU innlemmelse9. Selv om en kraftig tilnærming, BrdU/PI Flow flowcytometri har sine ulemper. Det er ikke i stand til å løse de G2/M og G0/G1 fasene uten inkludering av fase-spesifikke antistoffer. Imidlertid er antall antistoffer som kan brukes begrenset av mobilnettet autofluorescence, Spectral smitteeffekter av fluoroforen utslipp, og bruk av kompensasjon kontroller. Denne begrensningen markes det mer utfordrende og arbeidskrevende å co-oppdage uttrykk for celle syklus markører med POI. En mer facile tilnærming er å bruke masse flowcytometri10,11. Denne teknologien bruker metall bøyd antistoffer som har et smalere gjenkjennings spektrum. Når cellene er farget med metall-merket antistoffer, de er fordampet, og metaller oppdages av flowcytometri tid-av-fly (CyTOF) masse massespektrometri. På grunn av disse egenskapene muliggjør masse flowcytometri den multiplex deteksjon av > 40 forskjellige markører ved hjelp av eksisterende plattformer10,11. I tillegg er det mulig å få strekkode prøver med metaller som resulterer i besparelser av dyrebare antistoffer, samtidig som fargevariasjonen i prøve-til-prøver reduseres. På den annen side, masse flowcytometri har flere ulemper. Det er et begrenset antall kommersielt tilgjengelige metall-kodede antistoffer for ikke-blod avledet celler. Kvantifisering av DNA-innhold er mindre følsom i forhold til bruk av fluorescerende DNA fargestoffer og masse flowcytometri har et redusert dynamisk område av signal deteksjon i forhold til fluorescens flyt flowcytometri.
Protokollen beskrevet her var utformet for å analysere celle syklus dynamikk fra nylig isolerte keratinocytter (KCs) fra mus hud og karakterisere celle syklus bestemt protein uttrykk i disse cellene ved hjelp av masse flowcytometri. Denne protokollen kan også brukes med kulturperler celler eller tilpasset andre celletyper.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen som er skissert i denne utredningen kan gjennomføres i ca 8 h. Sluttresultatet er en suspensjon av celler beriket i KCs som kan analyseres for protein uttrykk i en celle syklus-avhengig måte. Flere tidligere studier har skissert metoder for å isolere KCs fra menneske og mus Skin16,25. Disse studiene inkluderer også protokoller for isolering av KCs for Flow flowcytometri26. Imidlertid har en detaljert protokoll ikke blitt ti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Støtte for dette arbeidet kom fra Department of Dermatology, den Gates Center for regenererende medisin ved University of Colorado og University of Colorado (UC) Skin sykdom Center morfologi og bestemmelse av fenotype Cores (NIAMS P30 AR057212). Forfatterne erkjenner UC Cancer Center Flow flowcytometri delt ressurs og støtte stipend (NCI P30 CA046934) for driften av massen flowcytometer og er takknemlige for Karen Helm og Christine Childs i kjernen for deres ekspertråd om flyt og masse analytiske Teknikker.
Materials
| 12-well plate | Cell Treat | 229512 | |
| Intercalator solution | Fluidigm | 201192A | 125 µM – Ir intercalator solution |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 30525-89-4 | 16 % PFA |
| Strainer cap flow tubes | Fisher/Corning | 352235 | 35 µm pore size |
| Cell sieve | Fisher | 22363547 | 40 μm pore size |
| Cell detatchment solution | CELLnTEC | CnT-ACCUTASE-100 | Accutase |
| Iodine Solution | ThermoFisher/Purdue | 67618-151-17 | Betadine 7.5%-iodine surgical scrub |
| Barcode permeabilization buffer | Fluidigm | 201060 | Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit |
| Barcodes | Fluidigm | 201060 | Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit |
| pH strips | EMD | 9590 | colorpHast |
| DMEM | Hyclone | SH30022.01 | Dulbecco’s Modified Eagle Media |
| Fine forceps | Dumont & Fils | 0109-5-PO | Dumostar #5 |
| Curved precision forceps | Dumont & Fils | 0109-7-PO | Dumostar #7 |
| Calibration Beads | Fluidigm | 201078 | EQ Four Element Calibration Beads |
| HBSS | Gibco | 14175-095 | Hank's Balanced Salt Solution |
| Water | Fisher | SH30538.03 | Hyclone Molecular Biology grade water |
| Iododeoxyuridine | Sigma | I7125 | IdU |
| Cryo vials | ThermoFisher | 366656PK | internal thread |
| Cell Staining buffer | Fluidigm | 201068 | Maxpar Cell Staining buffer |
| Fix & Perm buffer | Fluidigm | 201067 | Maxpar Fix & Perm buffer |
| Fix I buffer | Fluidigm | 201065 | Maxpar Fix I buffer |
| Phosphate buffered saline | Rockland | MB-008 | Metal free 10x PBS |
| isopropanol-freezing container | ThermoFisher | 5100-0001 | Mr.Frosty |
| Sodium hydroxide | Fisher | BP359-500 | NaOH |
| Petri dish | Kord-Valmark | 2900 | Supplied by Genesee 32-107 |
| 15 mL conical | Olympus/Genesee | 28-101 | |
| 50 mL conical | Olympus/Genesee | 28-106 | |
| 6-well plate | Cell Treat | 229506 | |
| Cisplatin | Sigma | 479306 | |
| Dispase II | Sigma/Roche | 4942078001 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Hydrochloric acid | Fisher | A144-212 | |
| Nuclear Antigen Staining permeabilization buffer | Fluidigm | 201063 | |
| Nuclear Antigen Staining buffer | Fluidigm | 201063 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| Tuberculin syringe | BD | 309626 | |
| Type IV Collagenase | Worthington Bioscience | CLSS-4 |
References
- Guzinska-Ustymowicz, K., Pryczynicz, A., Kemona, A., Czyzewska, J. Correlation between proliferation markers: PCNA, Ki-67, MCM-2 and antiapoptotic protein Bcl-2 in colorectal cancer. Anticancer Research. 29 (8), 3049-3052 (2009).
- Ladstein, R. G., Bachmann, I. M., Straume, O., Akslen, L. A. Ki-67 expression is superior to mitotic count and novel proliferation markers PHH3, MCM4 and mitosin as a prognostic factor in thick cutaneous melanoma. BioMedCentral Cancer. 10, 140 (2010).
- Ryan, W. K. Activation of S6 signaling is associated with cell survival and multinucleation in hyperplastic skin after epidermal loss of AURORA-A Kinase. Cell Death & Differentiation. , (2018).
- Magaud, J. P. Double immunocytochemical labeling of cell and tissue samples with monoclonal anti-bromodeoxyuridine. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 37 (10), 1517-1527 (1989).
- Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).
- Toth, Z. E., Mezey, E. Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Kraemer, P. M., Petersen, D. F., Van Dilla, M. A. DNA constancy in heteroploidy and the stem line theory of tumors. Science. 174 (4010), 714-717 (1971).
- Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).
- Bandura, D. R. Mass cytometry: technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma time-of-flight mass spectrometry. Analytical Chemistry. 81 (16), 6813-6822 (2009).
- Bjornson, Z. B., Nolan, G. P., Fantl, W. J. Single-cell mass cytometry for analysis of immune system functional states. Current Opinion in Immunology. 25 (4), 484-494 (2013).
- Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle. Cytometry A. 81 (7), 552-566 (2012).
- Brodie, T. M., Tosevski, V. High-Dimensional Single-Cell Analysis with Mass Cytometry. Current Protocols in Immunology. 118, 5.11.11-15.11.25 (2017).
- McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis. Journal of Visual Experimentation. 122, (2017).
- Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nature Protocols. 3 (5), 799-810 (2008).
- Zhang, L. Defects in Stratum Corneum Desquamation Are the Predominant Effect of Impaired ABCA12 Function in a Novel Mouse Model of Harlequin Ichthyosis. PLoS One. 11 (8), e0161465 (2016).
- Zunder, E. R. Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm. Nature Protocols. 10 (2), 316-333 (2015).
- Sumatoh, H. R., Teng, K. W., Cheng, Y., Newell, E. W. Optimization of mass cytometry sample cryopreservation after staining. Cytometry A. 91 (1), 48-61 (2017).
- Finck, R. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry A. 83 (5), 483-494 (2013).
- Trowbridge, I. S., Thomas, M. L. CD45: an emerging role as a protein tyrosine phosphatase required for lymphocyte activation and development. Annual Review of Immunology. 12, 85-116 (1994).
- Torchia, E. C., Boyd, K., Rehg, J. E., Qu, C., Baker, S. J. EWS/FLI-1 induces rapid onset of myeloid/erythroid leukemia in mice. Molecular and Cellular Biology. 27 (22), 7918-7934 (2007).
- Liu, Z. A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue. Journal of Visual Experimentation. (138), (2018).
- Jensen, K. B., Driskell, R. R., Watt, F. M. Assaying proliferation and differentiation capacity of stem cells using disaggregated adult mouse epidermis. Nature Protocols. 5 (5), 898-911 (2010).
- Germain, L. Improvement of human keratinocyte isolation and culture using thermolysin. Burns. 19 (2), 99-104 (1993).
- Fluhr, J. W. Impact of anatomical location on barrier recovery, surface pH and stratum corneum hydration after acute barrier disruption. British Journal of Dermatology. 146 (5), 770-776 (2002).
- Webb, A., Li, A., Kaur, P. Location and phenotype of human adult keratinocyte stem cells of the skin. Differentiation. 72 (8), 387-395 (2004).
- Torchia, E. C., et al. A genetic variant of Aurora kinase A promotes genomic instability leading to highly malignant skin tumors. 암 연구학. 69 (18), 7207-7215 (2009).
- Frei, A. P. Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells. Nature Methods. 13 (3), 269-275 (2016).
