בידוד וכתמים של העור העכבר Keratinocytes עבור ניתוח מחזור התא הספציפי של חלבון הביטוי הסלולרי על ידי המוני הקיקומטריה
Summary
פרוטוקול זה מתאר כיצד לבודד keratinocytes העור מדגמי העכבר, כדי להכתים עם מתכת מתויג נוגדנים, ולנתח תאים ויטראז על ידי cy, try המונית כדי לפרופיל את דפוס הביטוי של חלבונים של עניין בשלבים שונים מחזור התא.
Abstract
המטרה של פרוטוקול זה היא לזהות ולכמת ביטוי חלבון שינויים באופן תלוי מחזור התא באמצעות תאים בודדים מבודדים האפידרמיס של העור העכבר. ישנם שבעה צעדים חשובים: הפרדת האפידרמיס מן dermis, העיכול של האפידרמיס, כתמים של אוכלוסיות תאים באפידרמיס עם cisplatin טינית, מדגם barcoding, צביעת עם נוגדנים מתויג מתכת עבור סמנים מחזור התא וחלבונים של ריבית, זיהוי של נוגדנים מתויגים מתכת על ידי cy, המוניים לנסות, ואת ניתוח הביטוי בשלבים מחזור התא השונים. היתרון של גישה זו על שיטות היסטולוגית הוא הפוטנציאל לסדר את תבנית הביטוי של > 40 סמנים שונים בתא בודד בשלבים שונים של מחזור התא. גישה זו מאפשרת גם ניתוח מתאם מרובה משתנים של ביטוי חלבון הניתן לכימות יותר מאשר שיטות היסטולוגית/דימות. החיסרון של פרוטוקול זה הוא כי השעיה של תאים בודדים נדרש, אשר מביא לאובדן מידע מיקום שסופקו על ידי הצביעת של מקטעי רקמות. גישה זו עשויה גם לדרוש הכללה של סמנים נוספים כדי לזהות סוגים שונים של תאים בשעיות תא גולמי. היישום של פרוטוקול זה ניכרת בניתוח של מחלת עור hyperplastic מחלות. יתר על כן, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לניתוח של תת סוג ספציפי של תאים (למשל, תאי גזע) על ידי הוספת נוגדנים ספציפיים לשושלת היוחסין. פרוטוקול זה יכול גם להיות מותאם לניתוח של תאי העור במינים ניסיוניים אחרים.
Introduction
קורלציה של ביטוי גנים עם שלבי מחזור התא נשאר אתגר בניתוח של מודלים בעלי חיים של מחלות hyperplastic כמו סרטן. חלק מאתגר זה הוא שיתוף זיהוי של חלבונים של עניין (פוי) עם סמנים של התפשטות. תאים מתרבים ניתן למצוא שלבים שונים מחזור התא כולל G1, S, G2, ו-M. Ki67 הוא אחד הסמנים הנפוצים ביותר של התפשטות והוא מתבטא בכל השלבים של מחזור התא. זה נעשה בשימוש נרחב בניתוח של רקמות האדם והעכבר1,2,3. עם זאת, כמו סמני התפשטות כלליות אחרים, Ki67 אינו משנה שלבים במחזור תאים בודדים. גישה מדויקת יותר משתמשת התאגדות של הנוקלאוטידים האנמיטין האנלוגיים כמו ברומאודאוקסילדין (brdu) לתאים הנמצאים באופן פעיל משכפל הגנום שלהם (כלומר, S-שלב)4,5. חיסרון אחד לשימוש של נוקלאוטיד מקבילים הוא הצורך לנהל אותם לחיות בחיים שעות לפני הניתוח. Ki67 ו BrdU מזוהים בדרך כלל על מקטעים רקמה קבועה על ידי שימוש של נוגדנים. אחד היתרונות של גישה זו היא כי המיקום של POIs ניתן לברר בתוך הארכיטקטורה רקמה (למשל, שכבת הבסיס של אפידרמיס העור). גישה זו גם אינה דורשת דיסוציאציה של רקמות שעלולה להוביל לשינויים בביטוי הגנים. חיסרון אחד הוא כי קיבוע רקמות או עיבוד של הרקמה עבור OCT קפוא או הפרפין מאפשר לסגר מטרות נוגדנים (כלומר, אנטיגנים). אחזור של אנטיגנים בדרך כלל דורש עיכול חום או רקמה. הכמת של עוצמות מכתים יכול גם להיות מאתגר. הדבר נובע מווריאציות של כתמים, עובי מקטעים, זיהוי אותות והטיית מע. יתר על כן, מספר מוגבל של סמנים ניתן להבחין בו זמנית ברוב הגדרות המעבדה טיפוסי. עם זאת, גישות חדשות יותר לצביעת מחדש מבטיחים להתגבר על מגבלות אלה; דוגמאות הן הדמיה מאסיבית של cy, והגברה אות של טירמידה6,7.
Cy, הזרמת הזרימה היא טכנולוגיה חזקה נוספת כדי לזהות תאים מתרבים. זה מאפשר זיהוי מולטיפלקס של סמנים בתאים זהים אך דורש הדיסוציאציה רקמות עבור סוגי תאים שאינם המטבטיים ביותר. ניתוח של תאים מתרבים נעשה באופן שגרתי על ידי שימוש בצבעים לאגד DNA (למשל, Propidium יודיד (PI))8. Cy, הזרמת מיתרים גם מאפשרת קביעה מדויקת יותר של שלבי מחזור התא כאשר ביחד עם זיהוי של התאגדות BrdU9. למרות גישה רבת עוצמה, BrdU/PI הזרימה cy, הזורם יש חסרונות שלה. אין אפשרות לפתור את השלבים G2/M ו-G0/G1 ללא הכללה של נוגדנים ספציפיים לפאזה. עם זאת, מספר נוגדנים שניתן להשתמש בו מוגבל על ידי הסלולר autoפלואורסצנטית, גולש ספקטרלי של פליטת fluorophore, ואת השימוש של שולטת פיצוי. מגבלה זו קומות אותו יותר מאתגרת ומפרך כדי לזהות את הביטוי של סמנים מחזור התא עם pois. גישה יותר נתיישב היא להשתמש cy, המסה המוני10,11. טכנולוגיה זו משתמשת בנוגדנים מצוצרים מתכת כי יש ספקטרום זיהוי צר. ברגע שהתאים מוכתמים בנוגדנים עם מתכת-מתויג, הם מתאדה, ואת המתכות שזוהו על ידי cy, לנסות זמן הטיסה (Cyתוף) המסה ספקטרומטריה. בשל מאפיינים אלה, cy, ההמוני הגדול מאפשר זיהוי של > 40 סמנים שונים באמצעות פלטפורמות קיימות10,11. בנוסף, ניתן לבצע דגימות ברקוד עם מתכות הגורמות לחיסכון של נוגדנים יקר תוך הפחתת דגימת לדוגמה לשונות מכתים. מצד שני, לציטומה ההמוני יש כמה חסרונות. יש מספר מצומצם של נוגדנים מסחרי זמין מתכת מתויג עבור תאים שאינם בדם נגזר. הכמת של תוכן ה-DNA הוא רגיש פחות לעומת השימוש של צבע ה-DNA פלורסנט ו cy, לנסות ההמוני יש טווח דינמי מופחת של זיהוי אותות לעומת זרם הזריחה cy, try.
הפרוטוקול המתואר כאן נועד לנתח את הדינמיקה מחזור התא מן keratinocytes מבודדים (KCs) מעור העכבר ולאפיין את מחזור התא ביטוי חלבון ספציפי בתאים אלה באמצעות cy, מאסה המונית. פרוטוקול זה יכול לשמש גם עם תאים מתורבתים או מותאמים לסוגי תאים אחרים.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המתואר בנייר זה ניתן להשלים בערך 8 h. התוצאה הסופית היא השעיה של תאים מועשר KCs שניתן לנתח עבור ביטוי חלבון באופן תלוי מחזור התא. מספר מחקרים קודמים יש שיטות מתווה לבידוד kcs מעור אדם ועכבר16,25. מחקרים אלה כוללים גם פרוטוקולים עבור בידוד של KCs עבור זרימה …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
תמיכה עבור עבודה זו הגיע מהמחלקה לדרמטולוגיה, מרכז השערים לרפואה רגנרטיבית באוניברסיטת קולורדו ואוניברסיטת קולורדו (UC) מחלת העור המרכז מורפולוגיה וליבות פנוטיפים (NIAMS P30 AR057212). המחברים מכירים את ה-UC סרטן מרכז זרימה Cy, משאב משותף ותמיכה מענק (NCI P30 CA046934) עבור הפעולה של cytometry המוני ואסירי תודה על קארן הלם וכריסטין צ’יילדס בליבה עבור הייעוץ המומחים שלהם על הזרימה המונית cy, המוני טכניקות.
Materials
| 12-well plate | Cell Treat | 229512 | |
| Intercalator solution | Fluidigm | 201192A | 125 µM – Ir intercalator solution |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 30525-89-4 | 16 % PFA |
| Strainer cap flow tubes | Fisher/Corning | 352235 | 35 µm pore size |
| Cell sieve | Fisher | 22363547 | 40 μm pore size |
| Cell detatchment solution | CELLnTEC | CnT-ACCUTASE-100 | Accutase |
| Iodine Solution | ThermoFisher/Purdue | 67618-151-17 | Betadine 7.5%-iodine surgical scrub |
| Barcode permeabilization buffer | Fluidigm | 201060 | Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit |
| Barcodes | Fluidigm | 201060 | Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit |
| pH strips | EMD | 9590 | colorpHast |
| DMEM | Hyclone | SH30022.01 | Dulbecco’s Modified Eagle Media |
| Fine forceps | Dumont & Fils | 0109-5-PO | Dumostar #5 |
| Curved precision forceps | Dumont & Fils | 0109-7-PO | Dumostar #7 |
| Calibration Beads | Fluidigm | 201078 | EQ Four Element Calibration Beads |
| HBSS | Gibco | 14175-095 | Hank's Balanced Salt Solution |
| Water | Fisher | SH30538.03 | Hyclone Molecular Biology grade water |
| Iododeoxyuridine | Sigma | I7125 | IdU |
| Cryo vials | ThermoFisher | 366656PK | internal thread |
| Cell Staining buffer | Fluidigm | 201068 | Maxpar Cell Staining buffer |
| Fix & Perm buffer | Fluidigm | 201067 | Maxpar Fix & Perm buffer |
| Fix I buffer | Fluidigm | 201065 | Maxpar Fix I buffer |
| Phosphate buffered saline | Rockland | MB-008 | Metal free 10x PBS |
| isopropanol-freezing container | ThermoFisher | 5100-0001 | Mr.Frosty |
| Sodium hydroxide | Fisher | BP359-500 | NaOH |
| Petri dish | Kord-Valmark | 2900 | Supplied by Genesee 32-107 |
| 15 mL conical | Olympus/Genesee | 28-101 | |
| 50 mL conical | Olympus/Genesee | 28-106 | |
| 6-well plate | Cell Treat | 229506 | |
| Cisplatin | Sigma | 479306 | |
| Dispase II | Sigma/Roche | 4942078001 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Hydrochloric acid | Fisher | A144-212 | |
| Nuclear Antigen Staining permeabilization buffer | Fluidigm | 201063 | |
| Nuclear Antigen Staining buffer | Fluidigm | 201063 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| Tuberculin syringe | BD | 309626 | |
| Type IV Collagenase | Worthington Bioscience | CLSS-4 |
References
- Guzinska-Ustymowicz, K., Pryczynicz, A., Kemona, A., Czyzewska, J. Correlation between proliferation markers: PCNA, Ki-67, MCM-2 and antiapoptotic protein Bcl-2 in colorectal cancer. Anticancer Research. 29 (8), 3049-3052 (2009).
- Ladstein, R. G., Bachmann, I. M., Straume, O., Akslen, L. A. Ki-67 expression is superior to mitotic count and novel proliferation markers PHH3, MCM4 and mitosin as a prognostic factor in thick cutaneous melanoma. BioMedCentral Cancer. 10, 140 (2010).
- Ryan, W. K. Activation of S6 signaling is associated with cell survival and multinucleation in hyperplastic skin after epidermal loss of AURORA-A Kinase. Cell Death & Differentiation. , (2018).
- Magaud, J. P. Double immunocytochemical labeling of cell and tissue samples with monoclonal anti-bromodeoxyuridine. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 37 (10), 1517-1527 (1989).
- Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).
- Toth, Z. E., Mezey, E. Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Kraemer, P. M., Petersen, D. F., Van Dilla, M. A. DNA constancy in heteroploidy and the stem line theory of tumors. Science. 174 (4010), 714-717 (1971).
- Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).
- Bandura, D. R. Mass cytometry: technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma time-of-flight mass spectrometry. Analytical Chemistry. 81 (16), 6813-6822 (2009).
- Bjornson, Z. B., Nolan, G. P., Fantl, W. J. Single-cell mass cytometry for analysis of immune system functional states. Current Opinion in Immunology. 25 (4), 484-494 (2013).
- Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle. Cytometry A. 81 (7), 552-566 (2012).
- Brodie, T. M., Tosevski, V. High-Dimensional Single-Cell Analysis with Mass Cytometry. Current Protocols in Immunology. 118, 5.11.11-15.11.25 (2017).
- McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis. Journal of Visual Experimentation. 122, (2017).
- Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nature Protocols. 3 (5), 799-810 (2008).
- Zhang, L. Defects in Stratum Corneum Desquamation Are the Predominant Effect of Impaired ABCA12 Function in a Novel Mouse Model of Harlequin Ichthyosis. PLoS One. 11 (8), e0161465 (2016).
- Zunder, E. R. Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm. Nature Protocols. 10 (2), 316-333 (2015).
- Sumatoh, H. R., Teng, K. W., Cheng, Y., Newell, E. W. Optimization of mass cytometry sample cryopreservation after staining. Cytometry A. 91 (1), 48-61 (2017).
- Finck, R. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry A. 83 (5), 483-494 (2013).
- Trowbridge, I. S., Thomas, M. L. CD45: an emerging role as a protein tyrosine phosphatase required for lymphocyte activation and development. Annual Review of Immunology. 12, 85-116 (1994).
- Torchia, E. C., Boyd, K., Rehg, J. E., Qu, C., Baker, S. J. EWS/FLI-1 induces rapid onset of myeloid/erythroid leukemia in mice. Molecular and Cellular Biology. 27 (22), 7918-7934 (2007).
- Liu, Z. A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue. Journal of Visual Experimentation. (138), (2018).
- Jensen, K. B., Driskell, R. R., Watt, F. M. Assaying proliferation and differentiation capacity of stem cells using disaggregated adult mouse epidermis. Nature Protocols. 5 (5), 898-911 (2010).
- Germain, L. Improvement of human keratinocyte isolation and culture using thermolysin. Burns. 19 (2), 99-104 (1993).
- Fluhr, J. W. Impact of anatomical location on barrier recovery, surface pH and stratum corneum hydration after acute barrier disruption. British Journal of Dermatology. 146 (5), 770-776 (2002).
- Webb, A., Li, A., Kaur, P. Location and phenotype of human adult keratinocyte stem cells of the skin. Differentiation. 72 (8), 387-395 (2004).
- Torchia, E. C., et al. A genetic variant of Aurora kinase A promotes genomic instability leading to highly malignant skin tumors. 암 연구학. 69 (18), 7207-7215 (2009).
- Frei, A. P. Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells. Nature Methods. 13 (3), 269-275 (2016).
