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면역학 및 감염병학

Análise de análogos de ácido Iofenoxico em pequeno mangusto indiano (Herpestes auropunctatus) sera para uso como um marcador biológico de vacinação contra a raiva oral

Published: May 31, 2019
doi:
10.3791/59373
, , , , , , ,
1US Department of Agriculture, Animal and Plant Health Inspection Service, Wildlife Services,National Wildlife Research Center, 2IDT Biologika GmbH,Am Pharmapark

Summary

Nós oferecemos mangustos prisionais placebo iscas de vacina contra a raiva oral com ácido etílico ou metil iofenóxico como um biomarcador e verificado captação de isca usando uma nova cromatografia líquida com espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS) método.

Abstract

O Mongoose indiano pequeno (auropunctatus de Herpestes) é um reservatório do vírus da raiva (rabv) em Puerto Rico e compreende sobre 70% de casos animais da raiva relatados anualmente. O controle da circulação de RABV em reservatórios de vida selvagem é tipicamente realizado por uma estratégia de vacinação contra a raiva oral (ORV). Atualmente não há vida selvagem ORV programa existe em Porto Rico. A pesquisa em vacinas orais da raiva e em vários tipos da isca para mangustos foi conduzida com resultados prometedores. O monitoramento do sucesso da ORV depende da estimativa da captação de iscas por espécies-alvo, o que tipicamente envolve a avaliação de uma alteração nos anticorpos neutralizantes da RABV (RVNA) pós-vacinação. Esta estratégia pode ser difícil de interpretar em áreas com um programa ORV de vida selvagem ativa ou em áreas onde o RABV é enzoótico e níveis de fundo de RVNA estão presentes em espécies de reservatórios. Em tais situações, um biomarcador incorporado com a vacina ou a matriz de isca pode ser útil. Nós oferecemos 16 mangustos em cativeiro placebo ORV iscas contendo ácido etil-iofenoxico (et-IPA) em concentrações de 0,4% e 1% dentro da isca e 0,14% na matriz de isca externa. Nós também oferecemos 12 mangustos cativos ORV iscas contendo ácido metil-iofenoxico (me-IPA) em concentrações de 0, 35%, 0, 7% e 0,14% na matriz de isca externa. Nós coletamos uma amostra do soro antes da oferta da isca e então semanalmente por até oito semanas de oferta do borne. Nós extraímos ácidos iophenoxic dos soros no acetonitrila e quantificamos usando a cromatografia líquida/espectrometria maciça. Foram analisados soros para et-IPA ou me-IPA por cromatografia líquida-espectrometria de massas. Nós encontramos a habilidade adequada da marcação por pelo menos oito e quatro semanas para o et-e o me-IPA, respectivamente. Ambos os derivados IPA poderia ser adequado para avaliação de campo de captação de isca ORV em Mongooses. Devido à longevidade do marcador em soros de Mangusto, o cuidado deve ser tomado para não confundir os resultados usando o mesmo derivado IPA durante avaliações consecutivas.

Introduction

O vírus da raiva (RABV) é um único lyssavirus encalhado do sentido negativo, e circula entre espécies diferentes do reservatório dos animais selvagens dentro das ordens Carnivora e Chiroptera. Várias espécies de mangusto são reservatórios de RABV, e o pequeno mangusto indiano (Herpestes auropunctatus) é o único reservatório em Porto Rico e outras ilhas caribenhas no hemisfério ocidental1,2,3 . O controle da circulação de RABV em reservatórios de vida selvagem é tipicamente realizado através de uma estratégia de vacinação contra a raiva oral (ORV). Nos Estados Unidos (EUA), esta atividade de gestão é coordenada pelo USDA/APHIS/Wildlife Services programa nacional de gestão da raiva (NRMP)4. Atualmente não há vida selvagem ORV programa existe em Porto Rico. Pesquisa em vacinas contra a raiva e vários tipos de isca para mangustos tem sido conduzido com resultados promissores sugerindo um programa ORV para mangustos é possível5,6,7,8.

O monitoramento do impacto da ORV depende da estimativa da captação de iscas por espécies-alvo, o que tipicamente envolve a avaliação de uma alteração na soroprevalência de anticorpos RV. No entanto, essa estratégia pode ser desafiadora em áreas com programas ativos de ORV de vida selvagem ou em áreas onde o VD é enzoótico e níveis de fundo de anticorpos neutralizantes RABV (RVNA) estão presentes em espécies de reservatórios. Em tais situações, um biomarcador incluído na isca ou a matriz de isca externa pode ser útil.

Vários marcadores biológicostêm sido utilizados para monitorizar a captação de iscas em numerosas espécies, incluindo guaxinins (Procyon lotor)9,10, Estats (Mustela arminho)11,12, texugos europeus ( Meles) 13, javalis selvagens (Sus scrofa)14, pequenos mangustos indianos15 e cães da pradaria (cynomysludovicianus)16,17, entre outros. Nos EUA, as iscas operacionais de ORV freqüentemente incluem um biomarcador de tetraciclina a 1% na matriz de isca para monitorar a captação de iscas18,19. Entretanto, os inconvenientes ao uso do tetraciclina incluem uma preocupação crescente sobre a distribuição dos antibióticos no ambiente e que a deteção do tetraciclina é tipicamente invasora, exigindo a extração ou a destruição do dente do animal para obter o osso amostras20. A rhodamina B foi avaliada como um marcador em uma variedade de tecidos e pode ser detectada usando luz ultravioleta (UV) e fluorescência no cabelo e bigodes10,21.

O ácido iofenoxico (IPA) é um pó branco, cristalino que tem sido utilizado para avaliar o consumo de iscas em coiotes (Canis latrans)22, Arctic Fox (Vulpes lagopus)23, Red Fox (VulpesVulpes)24, guaxinins 9 anos de , 25, javali14, cervos vermelhos (Cervus elaphus scoticus)26, Badgers europeus12 e furões (M. furo)27, entre várias outras espécies de mamíferos. Os tempos de retenção do IPA variam por espécies de menos de duas semanas em alguns marsupiais28,29, para pelo menos 26 semanas em ungulados26 e mais de 52 semanas em cães domésticos (Canis lupus familiaris)30. Os tempos de retenção também podem ser dependentes da dose31. O ácido iofenoxico liga-se fortemente à albumina sérica e foi historicamente detectado pela medição dos níveis de iodo no sangue32. Esta aproximação indireta foi suplantada por métodos da cromatografia líquida de capacidade elevada (HPLC) para medir diretamente concentrações do ácido iophenoxic com deteção UV33, e eventualmente com cromatografia líquida e espectrometria maciça (LCMS) 34,35. Para este estudo, foi desenvolvida uma cromatografia líquida altamente sensível e seletiva com método de espectrometria de massas em tandem (LC-MS/MS) que utiliza o monitoramento de múltiplas reações (MRM) para quantificar dois análogos do ácido iofenoxico. Nosso objetivo foi usar este método LC-MS/MS para avaliar a capacidade de marcação de 2-(3-hidroxi-2, 4, 6-triiodobenzilo) ácido propanoico (metil-IPA ou me-IPA) e 2-(3-hidroxi-2, 4, 6-triiodobenzilo) ácido butanóico (etil-IPA ou et-IPA) e quando entregues em um ORV isca para Mongooses em cativeiro.

Os Mongooses foram capturados vivos em armadilhas da gaiola iscas com as salsichas fumadas comercialmente disponíveis e o óleo de peixes. Mongooses foram alojados em individuais 60 cm x 60 cm x 40 cm gaiolas de aço inoxidável e alimentados com uma ração diária de ~ 50 g alimento de gato seco comercial, suplementado duas vezes por semana com uma coxa de frango disponível comercialmente. A água estava disponível ad libitum. Nós entregamos dois derivados de IPA, de ethyl-IPA e de methyl-IPA, aos mangustos cativos em baits do placebo ORV. Todas as iscas foram compostas de um blister de 28 mm x 20 mm x 9 mm com revestimento externo (doravante “matriz de isca”) contendo ovo de frango em pó e gelatina (tabela de materiais). As iscas continham 0,7 mL de água ou derivado do IPA e pesaram aproximadamente 3 g, dos quais ~ 2 g foi a matriz de isca externa.

Nós oferecemos 16 mangustos cativas et-IPA em três concentrações: 0,14% (2,8 mg et-IPA em ~ 2 g de matriz de isca; 3 machos [m], 3 fêmeas [f]), 0,4% (2,8 mg et-IPA em 0,7 ml de volume de blisters; 3M, 3F) e 1,0% (7,0 mg de etil-IPA em 0,7 ml de volume de blisters; 2m , 2f). A dose global de 2,8 mg corresponde a uma taxa de dose de 5 mg/kg27,36 e baseia-se num peso médio de mangusto de 560 g em Porto Rico. Nós selecionamos 1% como a concentração a mais elevada como a pesquisa sugere a aversão do gosto a alguns biomarcadores pode ocorrer em concentrações > 1% em algumas espécies37. Nós oferecemos somente a dose de 1% no bloco de bolha como a floculação impediu o soluto de dissolver-se no solvente suficientemente para ser incorporado uniformente na matriz da isca. Um grupo controle (2m, 1f) recebeu iscas cheias de água estéril e sem IPA. Nós oferecemos iscas para mangustos na parte da manhã (~ 8 a.m.) durante ou antes da alimentação de sua ração de manutenção diária. Restos de isca foram removidos após aproximadamente 24 horas. Foram coletadas amostras de sangue antes do tratamento, um dia após o tratamento e, em seguida, semanalmente até 8 semanas após o tratamento. Nós Anestesiaram mangustos pela inalação do gás do isoflurano e coletamos até 1,0 ml do sangue inteiro pelo punção venosa da veia craniana oca como descrita para furões38. Nós centrifugados amostras inteiras do sangue, sera transferido aos cryovials e armazenamos-os em-80 ° c até a análise. Nem todos os animais foram amostrados durante todos os períodos de tempo para minimizar os impactos do sangue repetido se baseia na saúde dos animais. Os animais de controle foram amostrados no dia 0, depois semanalmente por até 8 semanas após o tratamento.

Nós entregamos o me-IPA em três concentrações: 0, 35% (0,7 MGS), 0, 7% (1,4 MGS) e 0,14% (2,8 MGS), todos incorporados na matriz da isca, com 2 machos e 2 fêmeas por o grupo do tratamento. Dois machos e duas fêmeas receberam iscas cheias de água estéril e sem IPA. Os tempos de oferecimento da isca e a anestesia do Mongoose são descritos acima. Nós coletamos amostras de sangue antes do tratamento no dia 1, e então semanalmente até 4 semanas após o tratamento.

Foram testados dados de concentração sérica para normalidade e médias estimadas para concentrações séricas de IPA de diferentes grupos de tratamento. Utilizou-se um modelo linear misto para comparar as concentrações médias de et-IPA sérica agrupadas em indivíduos. O tipo da isca (matriz/bloco de bolha) era um efeito fixo além do que o dia experimental, visto que a identificação animal era um efeito aleatório. Todos os procedimentos foram executados utilizando software estatístico comum (tabela de materiais) e a significância foi avaliada em α = 0, 5.

Protocol

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais do USDA National Wildlife Research Center o protocolo de pesquisa aprovado QA-2597. Nota: o seguinte protocolo descreve o procedimento de análise para detectar o ácido metil-iofenoxico no soro de mangusto. Este método é a versão final de um processo iterativo que começou com a análise do ácido etil-iofenoxico no soro do Mongoose. Durante a avaliação inicial do ácido etil-iofenoxico foram f…

Representative Results

Os cromatogramas de íons representativos de uma análise do me-IPA são apresentados na Figura 1. O soro do Mongoose do controle (Figura 1a) ilustra o tempo de retenção de et-IPA (analyte substituto) e a ausência de me-IPA no tempo de retenção indicado. A amostra de controle de qualidade (Figura 1b) ilustra a separação de linha de base do me-IPA do et-IPA, bem como as transições de quantifi…

Discussion

O método de LC-MS/MS desenvolvido para os estudos utilizou a seletividade da monitoração múltipla da reação para quantificar com precisão o me-IPA e o et-IPA no soro do Mongoose. A seletividade da detecção de MS/MS também permitiu um protocolo simples de limpeza que dependesse unicamente de acetonitrila para precipitar proteínas do soro antes da análise.

Os ácidos iofenóxicos são solúveis em ACN, mas são praticamente insolúveis em água. Para excluir a água da extração da …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Esta pesquisa foi apoiada em parte pelo programa de pesquisa intramural do departamento de agricultura dos EUA, serviço de inspeção de saúde animal e vegetal, serviços de vida selvagem, programa nacional de gestão da raiva e IDT Biologika (Dessau-Rosslau, Alemanha).

Materials

Acetonitrile, Optima grade Fisher A996
Analytical balance Mettler Toledo XS204
C18 column, 2.1 x 50 mm, 2.5-µm particle size Waters Corp. 186003085
ESI Source Agilent  G1958-65138
Ethyl-iophenoxic acid, 97 % Sigma Aldrich N/A Lot MKBP5399V
Formic acid, LC/MS grade Fisher A117
LCMS software Agilent MassHunter Data Acquisition and Quantitative Analysis
Methyl-iophenoxic acid, 97 % (w/w) PR EuroChem Ltd. N/A Lot PR0709514717
Microanalytical balance Mettler Toledo XP6U
Microcentrifuge Eppendorf 5415C
MS/MS Agilent G6470A
N-Evap Organomation 115
Oral Rabies Vaccine Baits IDT Biologika, Dessau Rossleau, Germany N/A
Propyl-iophenoxic acid, 99 % (w/w) PR EuroChem Ltd. N/A Lot PR100612108RR
Repeat pipettor Eppendorf M4
Screw-top autosampler vial caps, PTFE-lined Agilent 5190-7024
Sodium chloride, Certified ACS grade Fisher S271
Statistical Software Package SAS Institute, Cary, North Carolina, USA N/A
Trifluoroacetic acid, 99 % Alfa Aesar L06374
UPLC Agilent 1290 Series
Vortex Mixer Glas-Col 099A PV6
0.2-mL pipettor tips Eppendorf 30089.413
0.5-mL pipettor tips Eppendorf 30089.421
1.5-mL microcentrifuge tubes Fisher 14-666-325
1250-µL capacity pipette tips GeneMate P-1233-1250
1-mL pipettor tips Eppendorf 30089.43
2-mL amber screw-top autosampler vials Agilent 5182-0716
5-mL pipettor tips Eppendorf 30089.456
80-position microcentrifuge tube rack Fisher 05-541-2
8-mL amber vials with PTFE-lined caps Wheaton 224754
70 % (v/v) isopropanol Fisher A459
100-1000 µL air displacement pipette Eppendorf ES-100
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