توصيف وتعريف الببتيد الموضحة من قبل أنجيوتنسين الثاني
Summary
وقد كان التنميط البروتيني للبروتينات التيروزين-نترات تقنية صعبة بسبب وفرة منخفضة من التعديل 3-nitrotyrosine. هنا نحن نوصف نهج جديد لإثراء nitropeptide والتنميط باستخدام أنجيوتنسين الثاني كنموذج. ويمكن توسيع هذه الطريقة لأنظمة أخرى في المختبر أو في الجسم الحي.
Abstract
المعايرة البروتينية هي واحدة من أهم التعديلات بعد الترجمة (PTM) على بقايا التيروزين ويمكن أن يسببها الإجراءات الكيميائية من أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) وأنواع النيتروجين التفاعلية (RNS) في الخلايا eukaryotic. تحديد دقيق لمواقع التغذية على البروتينات أمر بالغ الأهمية لفهم العمليات الفسيولوجية والمرضية المتعلقة بالنفية البروتين، مثل الالتهاب والشيخوخة والسرطان. وبما أن البروتينات النتراتية قليلة الوفرة في الخلايا حتى في ظل الظروف المستحثة، لم يتم تطوير أي أساليب عالمية وفعالة لتحديد خصائص مواقع التغذية البروتينية وتحديدها. هنا نحن وصف بروتوكول لإثراء nitropeptide باستخدام تفاعل خفض المواد الكيميائية ووضع العلامات البيوتين، تليها قياس الطيف الكتلي عالية الدقة. في طريقتنا، يمكن تحديد مشتقات نيتروبتيد بدقة عالية. أسلوبنا يعرض اثنين من المزايا مقارنة مع الأساليب التي تم الإبلاغ عنها سابقا. أولاً، يستخدم وضع العلامات ثنائي الميثيل لمنع الأمين الأساسي على nitropeptides، والتي يمكن استخدامها لتوليد نتائج كمية. وثانياً، تستخدم رابطة ثاني كبريتيد تحتوي على كاشف من NHS-البيوتين للتخصيب، ويمكن زيادة تخفيضه وألوكيلة لتعزيز إشارة الكشف على مطياف الكتلة. وقد تم تطبيق هذا البروتوكول بنجاح على نموذج الببتيد أنجيوتنسين الثاني في الورقة الحالية.
Introduction
النِيْتَرَة من بقايا التيروزين في البروتينات لتشكيل 3-nitrotyrosine ينظم العديد من العمليات البيولوجية. بسبب الخصائص الكيميائية المختلفة بين التيروزين و 3-nitrotyrosine، قد يكون البروتين النترات اضطراب نشاط إشارة1،2. لذلك، من المهم تطوير الأساليب التي يمكن أن تثري وتحدد مواقع التغذية على البروتينات بكفاءة. كما 3-nitrotyrosine هو تعديل وفرة منخفضة على البروتينات مقارنة مع أشكال أخرى من PTM، مثل الفوسفورية والاسيتيل، فإنه من الصعب تحديد مواقع النخلة الذاتية مباشرة من خطوط الخلايا أو عينات الأنسجة. ومع ذلك، تم تطوير منهجية استخدام قياس الطيف الكتلي (MS) لوصف نمط التجزؤ من nitrotpeptide (علىسبيل المثال، زان وDesiderio 3)، الذي يضع الأساس لأساليب جديدة من nitroproteomics.
حاليا، خطوة الإثراء تليها MS هي الاستراتيجية الأقوى لnitropeptide التنميط4،5. ويمكن تصنيف أساليب الإثراء إلى فئتين. ويستند فئة واحدة على الأجسام المضادة التي يمكن أن تعترف 3-nitrotyrosine على وجه التحديد، في حين أن الطبقة الأخرى تقوم على اشتقاق الكيميائية التي تقلل من مجموعة نيترو إلى مجموعة أمين4،5. للأسلوب القائم على الأجسام المضادة، يتم استخدام عمود تقارب النيتروتيروزين للتخصيب، والتي يتم من خلاله حل المادة المُشار عنها وتحليلها من خلال دقة عالية MS6،7. بالنسبة للأسلوب القائم على الاشتقاق الكيميائي، يجب حظر مجموعات الأمين في المحطة N من الببتيد أو يسين في الخطوة الأولى إما عن طريق أسيتيليشن، علامات متساوية الشبه لكمية نسبية ومطلقة (iTRAQ)، أو علامات كتلة جنبا إلى جنب (TMT) الكواشف. بعد ذلك، يتم استخدام المخفض للحد من النيتروتيروزين إلى أمينالتيوسين متبوعا بتعديل مجموعة الأمين شكلت حديثا، والتي تشمل ربط البيوتين، تحويل الببتيد الكبريتات، أو أنواع أخرى من أنظمة الوسم8،9، 10,11. وتستند معظم البروتوكولات التي أنشئت حتى الآن على البروتينات في المختبر الإفراط في النترات، بدلا من البروتينات النترات الذاتية.
في هذه الدراسة، تم تطوير إجراء معدل للاشتقاق الكيميائي من النيتروتيروزين لإثراء nitropeptide وتحديد، والذي يظهر حساسية معززة أثناء الكشف عن التصلب المتعدد ومناسبة لغرض القياس الكمي. حددت دراستنا الأخيرة التي تستخدم هذه الطريقة في النظم البيولوجية أن النفية من البروتين التيروزين كيناز (LCK) محددة اللمفاوية (LCK) في Tyr394 من قبل RNS المنتجة من الخلايا المثبطة المشتقة من النخاع (MDSCs) يلعب دورا هاما في كبت المناعة من الورم microenvironment12. ولذلك، يمكن تطبيق طريقة تحديد nitropeptide لدينا على العينات البيولوجية المعقدة كذلك. هنا، ونحن نوصف بروتوكوللدينا باستخدام نموذج الببتيد أنجيوتنسين الثاني، الذي هو معروف نمط التجزؤ وتستخدم على نطاق واسع في الدراسات nitroproteomic8،9،10،11، على سبيل المثال.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف البروتوكول هنا ال [نيتروببتيد] إغناء وتوصيف. باستخدام أنجيوتنسين الثاني كما الببتيد نموذج, أوضحنا الإجراء المبين في الشكل 1. بعد الحصول على نيترو-أنجيوتنسين الثاني، ينبغي أن يتم حظر الأمين الأساسي على الببتيد لتجنب مزيد من اقتران الأمين، والتي هي واحدة من الخطوات الأك?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل من قبل جمعية السرطان الأمريكية منحة البحوث المؤسسية IRG-14-195-01 (M. شارون المكدس هو المحقق الرئيسي; X.L. هو محقق المتلقي الفرعي). وقد أمكن هذا المنشور بدعم جزئي من عدد المنح KL2 TR002530 وUL1 TR002529 (A. Shekhar, PI) من المعاهد الوطنية للصحة، المركز الوطني للنهوض بالعلوم الترجمة، وجائزة العلوم السريرية والترجمة. X. L. هو الحائز على جائزة إنديانا CTSI KL2 المحقق الشباب. S. F. ويدعم هاثر مؤسسة السرطان النهوض المنح الأساسية للسرطان. يدعم البرنامج العام للمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 817773047) س. دبليو.
Materials
| Acclaim pepmap 100 C18 column | Thermo-Fisher | 164534 | |
| 1 M TEAB solution | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| 50% hydroxylamine | Thermo-Fisher | 90115 | |
| Acetonitrile | Thermo-Fisher | A955 | MS Grade |
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Molecular Biology Grade |
| formaldehyde-D2 | Toronto Research Chemicals | F691353 | |
| formic acid | Sigma-Aldrich | 695076 | ACS reagent |
| Fusion Lumos mass spectrometer | Thermo | ||
| isoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| Methanol | Thermo-Fisher | A456 | MS Grade |
| NHS-S-S-bition | Thermo-Fisher | 21441 | |
| Oasis HLB column (10 mg) | Waters | 186000383 | |
| peroxynitrite | Merck-Millipore | 516620 | |
| sodium cyanoborohydrite | Sigma-Aldrich | 42077 | PhamaGrade |
| sodium dithionate | Sigma-Aldrich | 157953 | Technical Grade |
| Streptavidin Sepharose | GE Healcare | GE17-5113-01 | |
| Ultimate 3000 nanoLC | Thermo |
References
- Radi, R. Nitric oxide, oxidants, and protein tyrosine nitration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4003-4008 (2004).
- Radi, R. Protein tyrosine nitration: biochemical mechanisms and structural basis of functional effects. Accounts of Chemical Research. 46, 550-559 (2013).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. MALDI-induced fragmentation of leucine enkephalin, nitro-Tyr-leucine enkaphalin, and d5-Phe-nitro-Tyr-leucine enkephalin. Int. J Mass Spectrometry. 287, 77-86 (2009).
- Batthyány, C., et al. Tyrosine-Nitrated Proteins: Proteomic and Bioanalytical Aspects. Antioxidants & Redox Signaling. 26, 313-328 (2017).
- Feeney, M. B., Schöneich, C. Proteomic approaches to analyze protein tyrosine nitration. Antioxidants & Redox Signaling. 19, 1247-1256 (2013).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Nitroproteins from a human pituitary adenoma tissue discovered with a nitrotyrosine affinity column and tandem mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 354, 279-289 (2006).
- Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. Mass spectrometry analysis of nitrotyrosine-containing proteins. Mass Spectrometry Reviews. 34, 423-448 (2015).
- Abello, N., Barroso, B., Kerstjens, H. A. M., Postma, D. S., Bischoff, R. Chemical labeling and enrichment of nitrotyrosine-containing peptides. Talanta. 80, 1503-1512 (2010).
- Chiappetta, G., et al. Quantitative identification of protein nitration sites. Proteomics. 9, 1524-1537 (2009).
- Dekker, F., Abello, N., Wisastra, R., Bischoff, R. Enrichment and detection of tyrosine-nitrated proteins. Current Protocols in Protein Science. , (2012).
- Zhang, Q., et al. A method for selective enrichment and analysis of nitrotyrosine-containing peptides in complex proteome samples. Journal of Proteome Research. 6, 2257-2268 (2007).
- Feng, S., et al. Myeloid-derived suppressor cells inhibit T cell activation through nitrating LCK in mouse cancers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, 10094-10099 (2018).
- Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nature Protocol. 4, 484-494 (2009).
