Nitropeptide profilering og identifisering illustrert av angiotensin II
Summary
Proteomikk profilering av tyrosin-Nitro proteiner har vært en utfordrende teknikk på grunn av den lave overflod av 3-nitrotyrosine modifikasjon. Her beskriver vi en ny tilnærming for nitropeptide berikelse og profilering ved å bruke angiotensin II som modell. Denne metoden kan utvides for andre in vitro -eller in vivo -systemer.
Abstract
Protein nitreringsbestandighet er en av de viktigste post-translational modifikasjoner (PTM) på tyrosin rester og det kan bli indusert av kjemiske handlinger av reaktive oksygen arter (ROS) og reaktive nitrogen arter (RNS) i eukaryote celler. Presis identifisering av nitreringsbestandighet områder på proteiner er avgjørende for å forstå fysiologiske og patologiske prosesser knyttet til protein nitreringsbestandighet, slik som betennelser, aldring og kreft. Siden Nitro proteiner er av lav overflod i celler selv under indusert forhold, ingen universelle og effektive metoder har blitt utviklet for profilering og identifisering av protein nitreringsbestandighet nettsteder. Her beskriver vi en protokoll for nitropeptide berikelse ved hjelp av en kjemisk reduksjons reaksjon og biotin merking, etterfulgt av høy oppløsning masse massespektrometri. I vår metode kan nitropeptide derivater identifiseres med høy nøyaktighet. Vår metode har to fordeler sammenlignet med tidligere rapporterte metoder. Først, dimethyl merking brukes til å blokkere det primære Amin på nitropeptides, som kan brukes til å generere kvantitative resultater. For det andre brukes en disulfide obligasjon som inneholder NHS-biotin-reagens for berikelse, som kan bli ytterligere redusert og alkylated for å forbedre deteksjons signalet på en masse spektrometer. Denne protokollen har blitt brukt på modellen peptid angiotensin II i gjeldende papir.
Introduction
Nitreringsbestandighet av tyrosin rester i proteiner for å danne 3-nitrotyrosine regulerer mange biologiske prosesser. På grunn av de forskjellige kjemiske egenskapene mellom tyrosin og 3-nitrotyrosine, kan et Nitro protein ha perturbed signal aktivitet1,2. Derfor er det viktig å utvikle metoder som kan berike og identifisere nitreringsbestandighet områder på proteiner effektivt. Som 3-nitrotyrosine er en lav overflod modifikasjon på proteiner i forhold til andre former for PTM, som fosforylering og acetylering, er det utfordrende å identifisere endogene nitreringsbestandighet områder direkte fra cellelinjer eller vevsprøver. Likevel, metodikk for å bruke masse massespektrometri (MS) til å karakterisere fragmentering mønster av nitrotpeptide er utviklet (for eksempel Zhan & Desiderio3), som legger grunnlaget for nye metoder for nitroproteomics.
Aktuelle, en berikelse steg føle etter av MULTIPLE SCLEROSIS er de fleste kraftfull strategi for nitropeptide profilering4,5. Den berikelse metoder kan klassifiseres i to klasser. En klasse er basert på antistoffer som kan gjenkjenne 3-nitrotyrosine spesielt, mens den andre klassen er basert på den kjemiske avledning som reduserer en Nitro gruppe til et Amin gruppe4,5. For antistoff-basert metode, nitrotyrosine affinitet kolonnen brukes for berikelse, som eluert materialet er ytterligere løst og analyseres av høy oppløsning MS6,7. For kjemisk avledning-basert metode, Amin grupper ved N-Terminus av peptid eller lysin bør være blokkert i første trinn enten ved acetylering, isobar koder for relative og absolutte kvantifisering (iTRAQ), eller tandem Mass Tags (TMT) reagenser. Deretter brukes et redusering for å redusere nitrotyrosine til aminotyrosine etterfulgt av å endre den nyopprettede Amin gruppen, som inkluderer biotin ligation, sulphydryl peptid konvertering, eller andre typer tagging systemer8,9, 10,11. De fleste protokollene som er etablert så langt er basert på in vitro -Nitro proteiner, istedenfor endogenously Nitro proteiner.
I denne studien, en modifisert prosedyre av kjemisk avledning av nitrotyrosine er utviklet for nitropeptide berikelse og identifisering, som viser forbedret følsomhet under MS deteksjon og er egnet for kvantifisering formål. Vår nylige studien ansette denne metoden i biologiske systemer identifisert som nitreringsbestandighet av lymfocytter-spesifikke protein tyrosin kinase (LCK) på Tyr394 av RNS produsert fra myelogen-avledet Suppressor celler (MDSCs) spiller en viktig rolle i immunsuppresjon av tumor mikromiljøet12. Derfor vår metode for nitropeptide identifisering kan brukes til komplekse biologiske prøver også. Her beskriver vi vår protokoll ved hjelp av modellen peptid angiotensin II, hvorav fragmentering mønsteret er kjent og mye brukt i nitroproteomic studier8,9,10,11, som et eksempel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen her beskriver nitropeptide berikelse og profilering. Bruke angiotensin II som modell peptid, illustrerte vi prosedyren vist i figur 1. Etter å ha innhentet Nitro-angiotensin II, den primære Amin på peptid bør blokkeres for å unngå ytterligere Amin Bøyning, som er en av de mest kritiske skritt i protokollen. I den gjeldende protokollen, dimethyl merking brukes til å blokkere den primære aminer av to grunner: for det første, gjør det oppkjøpet av kvantitative resultater…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av American Cancer Society institusjonelle Research Grant IRG-14-195-01 (M. Sharon stack er rektor etterforsker; X.L. er en subrecipient etterforsker). Denne publikasjonen ble gjort mulig med delvis støtte fra Grant Numbers KL2 TR002530 og UL1 TR002529 (A. Shekhar, PI) fra National Institutes of Health, nasjonalt senter for fremmarsj translational Sciences, Clinical og translational Sciences Award. X. L. er en mottaker av Indiana CTSI KL2 Young etterforsker Award. S. F. er støttet av Walther Cancer Foundation fremmarsj Basic Cancer tilskudd. X. W. støttes av National Natural Science Foundation i Kinas General program (Grant no. 817773047).
Materials
| Acclaim pepmap 100 C18 column | Thermo-Fisher | 164534 | |
| 1 M TEAB solution | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| 50% hydroxylamine | Thermo-Fisher | 90115 | |
| Acetonitrile | Thermo-Fisher | A955 | MS Grade |
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Molecular Biology Grade |
| formaldehyde-D2 | Toronto Research Chemicals | F691353 | |
| formic acid | Sigma-Aldrich | 695076 | ACS reagent |
| Fusion Lumos mass spectrometer | Thermo | ||
| isoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| Methanol | Thermo-Fisher | A456 | MS Grade |
| NHS-S-S-bition | Thermo-Fisher | 21441 | |
| Oasis HLB column (10 mg) | Waters | 186000383 | |
| peroxynitrite | Merck-Millipore | 516620 | |
| sodium cyanoborohydrite | Sigma-Aldrich | 42077 | PhamaGrade |
| sodium dithionate | Sigma-Aldrich | 157953 | Technical Grade |
| Streptavidin Sepharose | GE Healcare | GE17-5113-01 | |
| Ultimate 3000 nanoLC | Thermo |
References
- Radi, R. Nitric oxide, oxidants, and protein tyrosine nitration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4003-4008 (2004).
- Radi, R. Protein tyrosine nitration: biochemical mechanisms and structural basis of functional effects. Accounts of Chemical Research. 46, 550-559 (2013).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. MALDI-induced fragmentation of leucine enkephalin, nitro-Tyr-leucine enkaphalin, and d5-Phe-nitro-Tyr-leucine enkephalin. Int. J Mass Spectrometry. 287, 77-86 (2009).
- Batthyány, C., et al. Tyrosine-Nitrated Proteins: Proteomic and Bioanalytical Aspects. Antioxidants & Redox Signaling. 26, 313-328 (2017).
- Feeney, M. B., Schöneich, C. Proteomic approaches to analyze protein tyrosine nitration. Antioxidants & Redox Signaling. 19, 1247-1256 (2013).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Nitroproteins from a human pituitary adenoma tissue discovered with a nitrotyrosine affinity column and tandem mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 354, 279-289 (2006).
- Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. Mass spectrometry analysis of nitrotyrosine-containing proteins. Mass Spectrometry Reviews. 34, 423-448 (2015).
- Abello, N., Barroso, B., Kerstjens, H. A. M., Postma, D. S., Bischoff, R. Chemical labeling and enrichment of nitrotyrosine-containing peptides. Talanta. 80, 1503-1512 (2010).
- Chiappetta, G., et al. Quantitative identification of protein nitration sites. Proteomics. 9, 1524-1537 (2009).
- Dekker, F., Abello, N., Wisastra, R., Bischoff, R. Enrichment and detection of tyrosine-nitrated proteins. Current Protocols in Protein Science. , (2012).
- Zhang, Q., et al. A method for selective enrichment and analysis of nitrotyrosine-containing peptides in complex proteome samples. Journal of Proteome Research. 6, 2257-2268 (2007).
- Feng, S., et al. Myeloid-derived suppressor cells inhibit T cell activation through nitrating LCK in mouse cancers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, 10094-10099 (2018).
- Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nature Protocol. 4, 484-494 (2009).
