Misurazione della dipendenza da campo magnetico di rilassamento Spin-Lattice di iperpolarizzato [1-13C]pyruvate

Summary

Vi presentiamo un protocollo per misurare la dipendenza del campo magnetico del tempo di rilassamento spin-reticolo di ¹³composti arricchiti con C, iperpolarizzati per mezzo di polarizzazione nucleare dinamica, utilizzando una rilassantesi veloce ciclabile. In particolare, lo abbiamo dimostrato con [1-¹³C]pyruvate, ma il protocollo potrebbe essere esteso ad altri substrati iperpolarizzati.

Abstract

Il limite fondamentale per le applicazioni di imaging in vivo di composti iperpolarizzati arricchiti con ¹³C è i loro tempi finiti di rilassamento del reticolo spin. Vari fattori influenzano i tassi di rilassamento, come la composizione del buffer, il pH della soluzione, la temperatura e il campo magnetico. A quest’ultimo aspetto, il tempo di rilassamento del reticolo spin può essere misurato ai punti di forza dei campi clinici, ma nei campi inferiori, dove questi composti vengono erogati dal polarizzatore e trasportati alla risonanza magnetica, il rilassamento è ancora più veloce e difficile da misurare. Per comprendere meglio la quantità di magnetizzazione persa durante il trasporto, abbiamo usato la rilassantigia veloce in ciclizzazione del campo, con il rilevamento della risonanza magnetica di ¹³nuclei C a 0,75 T, per misurare la dispersione della risonanza magnetica nucleare del tempo di rilassamento giro-reticolo di iperpolarizzato [1-¹³C]pyruvate. La polarizzazione nucleare dinamica di dissoluzione è stata utilizzata per produrre campioni iperpolarizzati di piravavi ad una concentrazione di 80 mmol/L e pH fisiologico (7,8). Queste soluzioni sono state rapidamente trasferite a un rilassante veloce in bicicletta sul campo, in modo che il rilassamento della magnetizzazione del campione potesse essere misurato in funzione del tempo utilizzando un piccolo angolo di inversione calibrato (3-5 gradini). Per mappare la dispersione T₁ del C-1 di pyruvate, abbiamo registrato dati per diversi campi di rilassamento compresi tra 0,237 mT e 0.705 T. Con queste informazioni, abbiamo determinato un’equazione empirica per stimare il rilassamento del reticolo spin-attico del substrato iperpolarizzato all’interno della gamma citata di campi magnetici. Questi risultati possono essere utilizzati per prevedere la quantità di magnetizzazione persa durante il trasporto e per migliorare i progetti sperimentali per ridurre al minimo la perdita del segnale.

Introduction

L’imaging spettroscopico a risonanza magnetica (MRSI) può produrre mappe spaziali dei metaboliti rilevati dall’imaging spettroscopico, ma il suo uso pratico è spesso limitato dalla sua sensibilità relativamente bassa. Questa bassa sensibilità dell’imaging a risonanza magnetica in vivo e dei metodi di spettroscopia deriva dal piccolo grado di magnetizzazione nucleare ottenibile a temperature corporee e ragionevoli punti di forza del campo magnetico. Tuttavia, questa limitazione può essere superata dall’uso della polarizzazione nucleare dinamica (DNP) per migliorare notevolmente la magnetizzazione in vitro dei substrati liquidi, che vengono successivamente iniettati al metabolismo in vivo della sonda utilizzando MRSI^{1,2 , 3 (COM del} nome ^{, 4}. DNP è in grado di migliorare la magnetizzazione della maggior parte dei nuclei con spin nucleare diverso da zero ed èstato utilizzato per aumentare ^{la sensibilità all’IVA in vivo di 13 composti arricchiti con C come il pirovato 5 , 6 , bicarbonato 7,8}, fumarate⁹, lattato¹⁰, glutammina¹¹, e altri da più di quattro ordini di grandezza¹². Le sue applicazioni includono l’imaging della malattia vascolare^13,14,15, perfusione di organi¹³,^16,17,18, cancro rilevamento^{1,19,20,21,22}, staging tumorale^23,24e quantificazione della risposta terapeutica^{2 ,} 6 È ^{possibile: , 23} del 23 o ^{, 24} Mi lasa’ di ^{, 25 mi lato , 26}.

Il lento rilassamento del reticolo a spin è essenziale per il rilevamento in vivo con MRSI. I tempi di rilassamento del reticolo di spin (T₁s) nell’ordine di decine di secondi sono possibili per i nuclei con bassi rapporti giromagnetici all’interno di piccole molecole in soluzione. Diversi fattori fisici influenzano il trasferimento di energia tra una transizione di spin nucleare e il suo ambiente (reticolo) che porta al rilassamento, tra cui la forza del campo magnetico, la temperatura e la conformazione molecolare²⁷. Il rilassamento dipolare è ridotto in molecole per le posizioni di carbonio senza protoni collegati direttamente, e la deuterazione dei supporti di dissoluzione può ridurre ulteriormente il rilassamento dipolare dipolare intermolecolare. Sfortunatamente, i solventi deuterati hanno capacità limitate di estendere il rilassamento in vivo. L’aumento del rilassamento dei carbonili o degli acidi carboxilici (come il pirovato) può verificarsi ad alti punti di forza del campo magnetico a causa dell’anisotropia dello spostamento chimico. La presenza di impurità paramagnetiche dal percorso fluido durante la dissoluzione dopo la polarizzazione può causare un rapido rilassamento e deve essere evitata o eliminata utilizzando chelatori.

Esistono pochissimi dati per il rilassamento di ¹³composti contenenti C in campi bassi, dove il rilassamento del reticolo di spin potrebbe essere significativamente più veloce. Tuttavia, è importante misurare T₁ nei campi bassi per comprendere il rilassamento durante la preparazione dell’agente utilizzato per l’imaging in vivo, poiché gli agenti di contrasto iperpolarizzati sono di solito dispensati dall’apparato DNP vicino o al campo. Ulteriori fattori fisici come la concentrazione di substrato arricchito ¹³C, il pH della soluzione, i tamponi e la temperatura influenzano anche il rilassamento e di conseguenza hanno un effetto sulla formulazione dell’agente. Tutti questi fattori sono essenziali nella determinazione dei parametri chiave nell’ottimizzazione del processo di dissoluzione DNP e nel calcolo dell’entità della perdita del segnale che si verifica nel trasporto del campione dall’apparato DNP al magnete di imaging.

Le misurazioni della dispersione di risonanza magnetica nucleare (NMRD), cioè le misurazioni T_1, in funzione del campo magnetico vengono in genere acquisite utilizzando uno spettrometro NMR. Per acquisire queste misurazioni, si potrebbe utilizzare un metodo di chiusura quando il campione viene prima sgonfita fuori dallo spettrometro per rilassarsi in qualche campo determinato dalla sua posizione nel campo frangia del magnete^28,29,30 e poi rapidamente trasferito di nuovo nel magnete NMR per misurare la sua magnetizzazione rimanente. Ripetendo questo processo nello stesso punto del campo magnetico ma con crescenti periodi di rilassamento, si può ottenere una curva di rilassamento, che può poi essere analizzata per stimare T₁.

Usiamo una tecnica alternativa nota come relaxometry fast field-cycling^31,32,33 per acquisire i nostri dati NMRD. Abbiamo modificato un rilassante commerciale per il ciclismo sul campo (vedi Tabella dei Materiali),per le misurazioni T₁ di soluzioni contenenti nuclei ¹³C iperpolarizzati. Rispetto al metodo shuttle, il ciclo consente a questo relaxometer di acquisire sistematicamente i dati NMRD su una gamma più piccola di campi magnetici (da 0,25 mT a 1 T). Ciò si ottiene cambiando rapidamente il campo magnetico stesso, non la posizione del campione nel campo magnetico. Pertanto, un campione può essere magnetizzato ad un’elevata forza di campo, “rilassato” a una forza di campo inferiore, e poi misurato dall’acquisizione di un decadimento a induzione libera in un campo fisso (e frequenza Larmor) per massimizzare il segnale. Ciò significa che la temperatura del campione può essere controllata durante la misurazione e la sonda NMR non deve essere sintonizzata in ogni campo di rilassamento promuovendo l’acquisizione automatica su tutta la gamma del campo magnetico.

Concentrando i nostri sforzi sugli effetti dell’erogazione e del trasporto delle soluzioni iperpolarizzate a bassi campi magnetici, questo lavoro presenta una metodologia dettagliata per misurare il tempo di rilassamento del reticolo spin relaxometria sul campo per campi magnetici nell’intervallo da 0,237 mT a 0,705 T. I principali risultati dell’utilizzo di questa metodologia sono stati precedentemente presentati per [1-¹³C]pyruvate³⁴ e ¹³C-enriched sodio e bicarbonato di cesio³⁵ dove altri fattori come la concentrazione radicale e la dissoluzione di pH hanno sono stati studiati.

Protocol

1. Preparazione del campione NOTA: i passaggi 1.1-1.8 vengono eseguiti una sola volta Preparare 1 mL di stock 13C-enriched pyruvic acid solution, ampiamente utilizzato per la ricerca in vivo 1,2,5,6, costituito da 15-mmol/L di triarylmetil radicale sciolto in [1- 13 del sistema C]acido pirorvico (vedere Tabella dei mat…

Representative Results

La figura 2 presenta un esempio di sweep a microonde ad alta risoluzione a piena gamma per l’acido pirovico. Per il caso presentato, tale frequenza ottimale di microonde corrisponde a 94.128 GHz, evidenziata nell’inserto della figura. Il nostro sistema DNP può normalmente funzionare nell’intervallo da 93,750 GHz a 94,241 GHz con dimensioni del gradino di 1 MHz, tempo di polarizzazione fino a 600 s e potenza fino a 100 mW. Una gamma completa di frequenze è studiata solo per nuovi substrati….

Discussion

L’uso di DNP per migliorare l’acquisizione del segnale è una soluzione tecnica al segnale di risonanza magnetica insufficiente disponibile da ¹³nuclei C a concentrazioni limitate, come quelle utilizzate nelle iniezioni di animali, ma presenta altre sfide sperimentali. Ogni misurazione di rilassamento illustrata nella Figura 7 rappresenta una misura di un campione preparato in modo univoco perché non può essere ripolarizzato dopo la dissoluzione per la rimisurazione. Ciò porta …

Materials

[1-13C]Pyruvic Acid	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	677175
10mm NMR Tube	Norell, Inc., Morganton NC, USA	1001-8
De-ionized water
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	E5134
HyperSense Dynamic Nuclear Polarizer	Oxford Instruments, Abingdon, UK		Includes the following: "DNP-NMR Polarizer" software used to control and monitor the whole DNP polarizer; "RINMR" used to monitor the solid state polarization levels; "HyperTerminal" used to communicate the DNP software with the RINMR software that monitors the solid state polarization level. Also includes the MQC bench top spectrometer to monitor the liquid state polarization in conjunction with it own RINMR software
MATLAB R2017b	MathWorks, Natick, MA		Include scripts for non-linear fitting of magnetization decay over time and T1 NMRD analysis of hyperpolarized pyruvic acid.
OX063 Triarylmethyl radical	Oxford Instruments, Abingdon, UK
pH meter – SympHony	VWR International, Mississauga, ON., Canada	SB70P
ProHance	Bracco Diagnostics Inc.		Gadoteridol, Gd-HP-DO3A
Pure Ethanol (100% pure)	Commercial Alcohols, Toronto, ON, Canada	P016EAAN
Shim Coil			Developed in-house
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	S7653
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	S8045
SpinMaster FFC2000 1T C/DC	Stelar s.r.l., Mede (PV) Italy		Includes the software "AcqNMR" that is used to set experimental parameters, monitor the tuning and matching of the RF coil, loading different pulse sequences, calibrate flip angle, data acquisition and curve fitting, among other functions. Also includes a depth gauge, some weights and a depth stopper.
Trizma Pre-Set Crystals (pH 7.6)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T7943