Het uitvoeren van de spectroscopie op Plasmonic nanodeeltjes met transmissie-gebaseerde Nomarski-type differentiële interferentie contrast microscopie

Summary

Het doel van dit protocol is om een bewezen aanpak voor de bereiding van plasmonic nanodeeltjes monsters en voor het uitvoeren van enkele deeltjes spectroscopie op hen met differentiële interferentie contrast (DIC) microscopie detail.

Abstract

Differentieel interferentie contrast (DIC) microscopie is een krachtige imaging tool die het meest gebruikt wordt voor Imaging micro Scale objecten met behulp van zichtbare-bereik licht. Het doel van dit protocol is om een beproefde methode voor de voorbereiding van plasmonic nanodeeltjes monsters en het uitvoeren van enkele deeltjes spectroscopie op hen met DIC microscopie detail. Een aantal belangrijke stappen moeten zorgvuldig worden gevolgd om herhaalbare spectroscopie experimenten uit te voeren. Ten eerste kunnen oriëntatiepunten worden geëtst in het monster substraat, die helpt bij het lokaliseren van het monster oppervlak en in het bijhouden van de regio van belang tijdens experimenten. Vervolgens moet het substraat goed worden gereinigd van puin en verontreinigingen die anderszins kan belemmeren of obscure onderzoek van het monster. Zodra een monster goed is voorbereid, moet het optische pad van de Microscoop worden uitgelijnd, met behulp van Kohler verlichting. Met een standaard Nomarski stijl DIC Microscoop, rotatie van het monster kan nodig zijn, met name wanneer de plasmonic nanodeeltjes vertonen oriëntatie-afhankelijke optische eigenschappen. Omdat DIC microscopie heeft twee inherente orthogonale polarisatie velden, de golflengte-afhankelijke DIC contrast patroon onthult de oriëntatie van Rod-vormige plasmonic nanodeeltjes. Tot slot moeten de data-acquisitie en gegevensanalyses zorgvuldig worden uitgevoerd. Het is gebruikelijk om op DIC gebaseerde spectroscopie gegevens te vertegenwoordigen als een contrastwaarde, maar het is ook mogelijk om het als intensiteits gegevens te presenteren. In deze demonstratie van DIC voor enkele deeltjes spectroscopie, de focus ligt op sferische en Rod-vormige goud nanodeeltjes.

Introduction

Sinds de jaren tachtig is differentiële interferentie contrast (DIC) microscopie grotendeels gezien als een belangrijke imaging methode voor micro Scale objecten binnen de biologische wetenschappen. Nochtans, tijdens zijn ontwikkeling in de jaren ‘ 50 en de jaren ‘ 60, was het bedoeld als techniek voor materialen wetenschap¹. Met de recente vooruitgang in de materiële wetenschappen met betrekking tot plasmonic nanodeeltjes, heeft een verhoogde rente in de karakterisering van materialen met optische microscopie plaatsgevonden.

Vele optische technieken zijn zeker beschikbaar voor nanomateriaal karakterisering (b.v., donker gebied, helderveld, gepolariseerd licht, fluorescentie, enz.). Dark Field is zeer populair in nanodeeltjes onderzoek, maar het berust uitsluitend op de verzameling van Scatter en biedt beperkte informatie over complexe monsters². De fluorescentie kan nuttig zijn, maar slechts met steekproeven dat luminescentie of dat kan behoorlijk worden bevlekt. DIC microscopie heeft verschillende eigenschappen die het een waardevol instrument maken voor de analyse van nanodeeltjes. De meest voorkomende voordelen van DIC in vergelijking met andere methoden en met betrekking tot plasmonic nanodeeltjes zijn: geen monster kleuring vereist, geen halo effecten, ondiepe scherptediepte, en hoge zijdelingse resolutie³. DIC heeft extra sterke punten die waardevol zijn voor plasmonic nanodeeltjes onderzoek. Allereerst, twee inherente en orthogonale polarisatie velden aanwezig zijn, en ze kunnen gelijktijdig worden gemeten voor de spectroscopie doeleinden². Ten tweede wordt het gepolariseerde signaal van nanodeeltjes niet vastgelegd in het uiteindelijke beeld², wat een oorzaak kan zijn van ernstige bezorgdheid in de donkere veld spectroscopie metingen.

Het doel van dit artikel is het verstrekken van een duidelijke methodologie voor het gebruik van overdraagbare licht Nomarski DIC microscopie uit te voeren spectroscopie op plasmonic nanodeeltjes. Hoewel DIC is een krachtige techniek die kan worden toegepast op zeer diverse materialen, het is ook een techniek die vereist grote vaardigheid en begrip om goed te werken wanneer beeldvorming nanodeeltjes. Transmission-based Nomarski DIC microscopie heeft een complex licht pad¹ dat hier slechts kort zal worden herzien. De optische trein van DIC wordt weergegeven in Figuur 1. Het licht wordt overgebracht door de Microscoop door eerst te worden overgegaan door een polarisator en een straal-verdelend Nomarski prisma alvorens wordt geconcentreerd door de condensator op het steekproef vliegtuig. Na het passeren van de doelstelling, het licht ontmoetingen een Beam-combineren Nomarski prisma en een analysator voor het verlaten van de detector. De twee polarisatoren en Nomarski prisma’s zijn cruciaal voor de vorming van de DIC beeld en zijn verantwoordelijk voor de productie van DIC de twee orthogonale polarisatie velden¹. Voor de lezer geïnteresseerd in meer weten over de werkingsprincipes en optische pad van Nomarski DIC microscopen, of de verschillen tussen Nomarski DIC en andere stijlen van DIC, verwijzen wij u naar andere goed geschreven accounts over deze onderwerpen^{1, 4 , 5 , 6 , 7}.

Het is even belangrijk om de fundamentele aard van plasmonic nanodeeltjes te begrijpen alvorens te proberen de spectroscopie uit te voeren op hen, of het nu met Nomarski DIC, Dark Field, of een andere microscopie techniek. Op het gebied van plasmonics worden nanodeeltjes gedefinieerd als deeltjes met afmetingen op de schaal van 10-100 nm^8,9. Nanodeeltjes kunnen nemen op vele vormen (bijvoorbeeld bollen, staven, sterren, halters, enz.), en de meeste van hun belangrijke eigenschappen ontstaan door interacties met licht in de ultraviolet-zichtbare-near Infrarood bereik van het elektromagnetische spectrum. De term “plasmonic” is niet beperkt tot nanodeeltjes¹⁰; echter, bij de bespreking van nanodeeltjes, wordt het gebruikt in verwijzing naar gelokaliseerde oppervlakte Plasmon resonantie (LSPR). LSPR is een fenomeen waarbij de geleiding elektronen in een nanodeeltjes schommelen als gevolg van een Coulomb interactie met elektromagnetische straling van een zeer specifieke en relatief smalle frequentieband⁸. Bij deze zelfde frequenties, plasmonic nanodeeltjes vertonen verhoogde absorptie en verstrooiing van licht, waardoor ze waarneembaar met optische microscopie. In veel gevallen, is het de voorkeur aan de nanodeeltjes observeren tijdens het plaatsen van band filters voor de condensor², om het beeldcontrast te verbeteren en om het licht te elimineren dat niet aan de LSPR effect te induceren. Het gebruik van filters maakt het ook mogelijk om enkele deeltjes spectroscopie experimenten uit te voeren.

LSPR optische gedrag is sterk afhankelijk van de grootte en de vorm van de nanodeeltjes, en het kan worden onderzocht met veel optische microscopie technieken. Echter, om oriëntatie informatie van plasmonic nanodeeltjes te ontcijferen met een anisotropische (dwz, niet-sferische) vorm, is het noodzakelijk om gebruik te maken van polarisatie van het lichtveld. Door het polarisatie veld of het monster substraat bij kleine stappen zorgvuldig te roteren, is het mogelijk om de oriëntatie afhankelijke spectroscopie eigenschappen van afzonderlijke nanodeeltjes te monitoren. Rotatie en polarisatie kan ook helpen bij het bepalen of een spectrale functie is te wijten aan een dipolaire of hogere orde trilling van het oppervlak van de nanodeeltjes elektronen. Echter, in het geval van isotrope (dat wil zeggen, sferische) nanodeeltjes, het spectrale profiel blijft in wezen ongewijzigd bij het roteren van het monster onder gepolariseerd licht.

Wanneer ze worden bekeken door een DIC Microscoop (Figuur 2), hebben nanodeeltjes een luchtige schijf met een schaduw-gegoten wit-en-zwart uiterlijk tegen een grijze achtergrond. Sferische nanodeeltjes zullen deze verschijning onder rotatie en met het veranderen van band filters behouden; Nochtans, zullen de deeltjes geleidelijk aan van mening langzaam verdwijnen aangezien de centrale golflengte van het filter verder van de enige dipolaire LSPR golflengte¹¹van de bol wordt gescheiden. De verschijning van nanorods kan vrij dramatisch veranderen aangezien zij²worden gedraaid. Nanorods hebben twee LSPR banden met dipolaire gedrag, waarvan de locatie gebaseerd is op de fysieke afmetingen van de nanorods. Wanneer de longitudinale as van een nano staafje is gericht parallel aan een van de DIC polarisatie velden, zal de luchtige schijf verschijnen alle witte of alle zwarte als bekeken met een bandfilter geassocieerd met die LSPR golflengte. Na het roteren van de steekproef 90 °, zal het op de tegenovergestelde kleur. Als alternatief, aangezien de transversale as van een nano staafje loodrecht op de longitudinale as is, zal de staaf de tegenovergestelde kleur nemen wanneer het schakelen tussen filters die de LSPR golflengten voor de twee assen aanpassen. Bij andere oriëntaties en filter montages, zal nanorods meer als bollen verschijnen, die een verscheidenheid van schaduw-gegoten luchtige schijf patronen voorstellen. Voor nanorods met een transversale as < 25 nm, kan het moeilijk zijn om signaal op die LSPR golflengte te detecteren met behulp van DIC microscopie.

Voor het uitvoeren van enkele deeltjes spectroscopie, is het belangrijk om de juiste optische componenten te gebruiken en om ze goed af te stemmen. Er moet een doelstelling voor DIC microscopie worden gebruikt. Voor enkelvoudige deeltjes experimenten, 80x of 100x olie doelstellingen zijn ideaal. Nomarski DIC prisma’s komen gewoonlijk in drie variëteiten: standaard, hoog contrast, en hoge resolutie. Het ideale type hangt sterk af van het doel van het experiment en de grootte van de nanodeeltjes. Standaard prisma’s zijn prima voor vele experimenten; maar wanneer het werken met kleinere nanodeeltjes (< 50 nm), kunnen de hoog contrast prisma's voordelig zijn, aangezien het deeltjes contrast vermindert aangezien de deeltjes in grootte¹¹verminderen. Het aanpassen van de DIC contrast wordt bereikt, hetzij door het roteren van een polarisator of door het vertalen van een van de DIC prisma’s, afhankelijk van de Microscoop merk of model⁶.

Na het instellen van Kohler verlichting en de polarisator instellingen, is het van cruciaal belang om deze instellingen niet opnieuw aan te passen, terwijl het verzamelen van spectroscopie gegevens. Bovendien moet tijdens het verzamelen van gegevens altijd een constant gemiddeld achtergrond signaal worden bijgehouden, ook bij het schakelen tussen filters en hoek instellingen. De werkelijke ideale achtergrondwaarde is afhankelijk van het dynamisch bereik van de wetenschappelijke camera, maar in het algemeen moet de achtergrond in het bereik van 15%-40% van de maximale detectie niveau van de camera. Dit vermindert de kans op verzadiging van de camera sensor terwijl het optimale particle contrast mogelijk maakt. Voor het verzamelen van de spectroscopie gegevens, is het noodzakelijk om te werken met een wetenschappelijke camera die beelden in zwart-wit, in tegenstelling tot een kleurencamera vangt.

Sample voorbereiding is een ander kritisch aspect van de beeldvorming plasmonic nanodeeltjes. Het is noodzakelijk dat de exploitanten van DIC microscopie inzicht hebben in de optische eigenschappen van het monster en het substraat van het monster. “Pre-gereinigd” Microscoop glas is niet voldoende voorbereid voorbeeld vorming nanodeeltjes, en het moet goed worden opnieuw gereinigd voordat monster depositie om onbelemmerde waarneming van het monster te waarborgen. Veel reinigings protocollen voor Microscoop dia’s zijn eerder gedocumenteerd¹², maar het is niet een stap die normaalgesproken wordt gerapporteerd in experimentele studies.

Ten slotte, data-analysemethoden zijn de laatste component van enkele deeltjes spectroscopie. De maximum-en minimum intensiteiten voor elke nano partikel moeten worden gemeten, evenals het lokale achtergrond gemiddelde. De deeltjes van belang zouden in gebieden met geen achtergrond puin, substraat tekorten, of ongelijke verlichting moeten worden gevestigd. Een methode voor het bepalen van het spectrale Profiel van een nano partikel is door het berekenen van particle contrast bij elke golflengte, met behulp van de vergelijking onder^11,13,14,15:

Als alternatief kan het spectrum van een enkel deeltje worden gesplitst in zijn individuele maximum-en minimum signaal componenten, die de twee polarisatie velden van DIC vertegenwoordigen, waardoor de twee gelijktijdig verzamelde directioneel afhankelijke spectra worden weergegeven, door de twee vergelijkingen:

Protocol

1. Monstervoorbereiding met standaard glas microscopie dia’s Bereid glazen Microscoop dia’s voor monster depositie.Nota: in sommige omstandigheden, kan het meer aangewezen zijn om het glas in ultrapuur water in plaats van ethylalcohol op te slaan. Echter, het opslaan in water of lucht maakt het glas hydrofobe in de tijd. Voor de beste resultaten, de aankoop glas of Quartz Microscoop dia’s en cover glas. Met behulp van een pen, plaats een ondiep en korte Scratch merk op het centrum van elk…

Representative Results

Bij het werken met monsters die groot genoeg zijn om gezien te worden met het blote oog, het plaatsen van oriëntatiepunten op het glassubstraat is normaalgesproken niet nodig. Echter, bij het werken met nanomaterialen of wanneer rotatie van het monster is vereist, kunnen de oriëntatiepunten een eenvoudige methode voor het lokaliseren, onderscheiden en bijhouden van de oriëntatie van het monster. Hoewel meer verfijnde technieken kunnen worden gebruikt voor het verlaten van oriëntatiepu…

Discussion

Wanneer Imaging met DIC microscopie, is het essentieel om de optische componenten te optimaliseren voordat het verzamelen van gegevens. Zelfs kleine aanpassingen aan de polarisator in het midden van een experiment kan leiden tot significante effecten op de definitieve gegevens⁶. Bovendien, verschillende materialen vereisen verschillende polarisator instellingen. Hoewel grote stap maten werden hier gebruikt om het effect van de polarisatie hoek aan te tonen, in een effectief experiment, is het nood…

Materials

Contrad 70	Decon Labs, Inc.	1002	For cleaning microscope glass, Available through many chemical suppliers
Ethanol	Fisher Scientific	A962-4	For cleaning and storing microscope glass
Glass microscope cover slips	Ted Pella	260148
Glass microscope slides	Ted Pella	26007
Gold nanorods	Nanopartz	DIAM-SPR-25-650
Gold nanospheres (80 nm)	Sigma Aldrich	742023-25ML
ImageJ	NIH	N/A	Free Software availabe for data analysis from NIJ
Nail polish	Electron Microscopy Sciences	72180
Nikon Ti-E microscope	Nikon	N/A
Nitrogen gas	Airgas	N/A
ORCA Flash 4.0 V2+ digital sCMOS camera	Hamamatsu	77054098
Scribing pen	Amazon	N/A	Many options available online for under $10. Not necessary to buy an expensive version.
Ultrapure water			18 megaohm