Summary
קו הצינור המתואר מיועד לפילוח של נתונים מיקרוסקופ אלקטרונים הגדולים יותר מאשר ג'יגה-בתים, כדי לחלץ מורפולוגיות תא שלם. לאחר התאים משוחזרים ב-3D, תוכנה מותאמת אישית שתוכננה סביב צרכים בודדים ניתן להשתמש כדי לבצע ניתוח איכותי כמותי ישירות ב-3D, גם באמצעות מציאות וירטואלית כדי להתגבר על החסימה השקפה.
Abstract
הפרדה טורית והדמיה ברזולוציה גבוהה של רקמות ביולוגיות באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני (EM) מאפשרים פילוח ושחזור של ערימות הדמיה ברזולוציה גבוהה כדי לחשוף דפוסים אולטרה מבניים שלא ניתן לפתור באמצעות 2D תמונות. אכן, האחרון עלול להוביל לפרשנות של מורפולוגיות, כמו במקרה של המיטולוגיה; השימוש במודלים תלת-ממדיים הוא, ולכן, יותר ויותר נפוץ ומוחל על ניסוח השערות הפונקציונליות המבוססות על מורפולוגיה. עד היום, השימוש בדגמי תלת-ממד שנוצרו מערימות התמונות באור או באלקטרון הופך את ההערכות האיכותיות והחזותיות, כמו גם כימות, נוח יותר לביצוע ישירות ב-3D. כמו מודלים אלה הם לעתים קרובות מורכבים מאוד, סביבת מציאות וירטואלית חשוב גם להיות מוגדר כדי להתגבר על סגר ולנצל את מלוא מבנה התלת-ממד. כאן, מדריך צעד אחר צעד מפילוח תמונה לשחזור וניתוח מתואר בפרוטרוט.
Introduction
המודל הראשון שהוצע לכיוונון אלקטרון מיקרוסקופ המאפשר מקטע סדרתי אוטומטי והדמיה של התאריך בחזרה ל-19811; הדיפוזיה של כזה אוטומטי, כיוונונים משופרים כדי התמונה דגימות גדולות באמצעות EM גדל בעשר השנים האחרונות2,3, ועבודות לראווה שחזורים צפופים מרשימים או מורפולוגיות מלא מיד אחריו4, . חמש,שש,שבע,שמונה,9,10
הייצור של ערכות נתונים גדולות הגיע עם הצורך בצינורות משופרים עבור מקטעי תמונה. כלי תוכנה לפילוח ידני של סעיפים סדרתיים, כגון בנייה מTrakEM2 ו-11,12, עוצבו עבור מיקרוסקופ אלקטרוני שידור (TEM). ככל שהתהליך יכול לגזול זמן רב מאוד, כלים אלה אינם מתאימים בעת התמודדות עם אלפי מיקרוגרפים סדרתיים שניתן להפיק באופן אוטומטי באמצעות שיטות המצב העדכני והאוטומטי של מקטעים טוריים מסוג EM (3DEM), כגון סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים (SBEM)3 או קרן יון ממוקדת-סריקת מיקרוסקופ אלקטרוני (פרפור-SEM)2. מסיבה זו, מדענים הכניסו מאמצים לפיתוח כלים האוטומטים למחצה, כמו גם כלים אוטומטיים לחלוטין, כדי לשפר את היעילות של פילוח. כלים אוטומטיים לחלוטין, המבוססים על למידה ממוחשבת13 או המדינה-of-art, האלגוריתם סיווג פיקסל מאומן14, הם שופרו כדי לשמש קהילה גדולה יותר; אף על פי כן, פילוח עדיין רחוק מלהיות אמין לחלוטין, ועבודות רבות עדיין מבוססות על עבודה ידנית, שאינה יעילה במונחים של פילוח זמן, אך עדיין מספק אמינות מלאה. כלים האוטומטים למחצה, כגון ilastik15, מייצגים פשרה טובה יותר, כאשר הם מספקים בדיקה מיידית לפילוח שניתן לתקן במידה מסוימת, למרות שהיא אינה מספקת מסגרת הגהה אמיתית, וניתן לשלבם באמצעות TrakEM2 במקביל16.
פילוח בקנה מידה גדול הוא, עד כה, מוגבל בעיקר לחיבור מעגלים מיותרים; לפיכך, מדעני מחשב מעוניינים ביותר לספק מסגרות לפריטים חזותיים משולבים של קבוצות נתונים גדולות ומבוארות ולנתח דפוסי קישוריות שבהם הנוכחות של אנשי קשר סינפטית17,18. עם זאת, שחזורים תלת-ממדיים מדויקים ניתן להשתמש עבור ניתוחים מורמטרים כמותיים, במקום הערכות איכותיות של מבני תלת-ממד. כלים כמו עצבי19,20 ו ניתוח הגליקוגן10 פותחו כדי לקחת מדידות על שחזורים 3d עבור אורכי, פני שטח, ואמצעי אחסון, ועל התפלגות של נקודות ענן, לחלוטין . מחיקת המחסנית המקורית8,10 Astrocytes מייצגים מקרה מעניין, כי העדר רמזים חזותיים או דפוסים מבניים חוזרים לתת לחוקרים רמז על הפונקציה של יחידות מבניים בודדים העדר היעדר של האונטולוגיה הנאותה של תהליכים astrocytic 21, להפוך אותו מאתגר לעצב כלים אנליטיים. ניסיון אחד לאחרונה היה מופשט22, אשר מאפשר חקר ויזואלי של תהליכים astrocytic ואת היסק של יחסים איכותניים בין תהליכים astrocytic ו neurites.
עם זאת, הנוחות של רקמות הדמיה מנות מתחת EM מגיע העובדה כי כמות המידע החבוי בדגימות מוח שלמים הוא עצום ולפרש בסעיף אחד תמונות יכול להתגבר על בעיה זו. צפיפות של מבנים במוח הוא כל כך גבוה, כי 3D שחזורים של אפילו כמה אובייקטים לעין פעם אחת יהיה להפוך את זה בלתי אפשרי להבחין אותם חזותית. מסיבה זו, הציעו לאחרונה את השימוש במציאות הווירטואלית (VR) כשיטה משופרת להתבונן במבנים מורכבים. אנו מתמקדים באסטרוציטים23 כדי להתגבר על חסימה (שהיא חסימת הניראות של אובייקט מעניין עם אחד השני, במרחב תלת-ממד) ולהקל על הערכות איכותניות של שחזורים, כולל הגהה, כמו גם כימות של תכונות באמצעות ספירה של נקודות בחלל. לאחרונה שולבו VR חיפושי חזותי עם שימוש של גלאם (הגליקוגן נגזר לקטט מודל הקליטה), טכניקה כדי להמחיש מפה של הסתברות המעבורת לקטט של neurites, על ידי שוקל גרגרי הגליקוגן כגופים פולטות אור23; בפרט, השתמשנו VR לכמת את פסגות האור המיוצר על ידי גלאם.
Protocol
1. עיבוד תמונה באמצעות פיג'י
- פתח את ערימת התמונות על-ידי גרירה ושחרור הקובץ המקורי מהמיקרוסקופ המכיל את המחסנית, או על-ידי גרירה ושחרור התיקיה המכילה את מחסנית התמונה כולה לחלון התוכנה.
הערה: פיג'י מסוגל לזהות באופן אוטומטי את כל תבניות התמונות הסטנדרטיות, כגון. jpg,. tif ו-png, כמו גם תבניות קובץ קנייניות מספקי מיקרוסקופ. בעוד שהפרוטוקול הבא מיטבי עבור ערימות של תמונות מ-3DEM, שלבים אלה עשויים לשמש גם עבור ערכות נתונים מיקרוסקופית אור. - לאחר פתיחת המחסנית, עבור לתמונה > מאפיינים כדי לוודא שגודל ה-voxel נקרא מהמטא-נתונים. אם לא, ניתן להזין אותו באופן ידני.
- הקפד להפוך את התמונה לתוך 8 סיביות. לחץ על תמונה ≫ סוג ובחר 8 סיביות.
- אם המחסנית המקורית הייתה בקבצים/תיקיות רציפים שונים, השתמש בשרשור כדי למזג אותם בערימה אחת על-ידי בחירת התמונה ≫ ערימות > כלים > שרשר.
- שמור את המחסנית על-ידי בחירת קובץ > שמירה בשם. הוא יישמר כקובץ. tif יחיד וניתן להשתמש בו כגיבוי ולעיבוד נוסף.
- אם המחסנית המקורית נרכשת כאריחים שונים, החל את התפרים בתוך TrakEM2.
- צור פרוייקט TrakEM2 חדש באמצעות ≫ TrakEM2 חדש (ריק).
- בתוך ממשק המשתמש הגרפי אשנב (GUI), לייבא את הערימות על ידי לחיצה על לחצן העכבר הימני > ייבוא > מחסנית ייבוא, ולייבא את כל האריחים נפתח GUI הראשי של פיג'י. הקפד לשנות את גודל בד הציור כך שיתאים לערימה כולה על-ידי לחיצה ימנית > הצג > שנה גודל של ערכת בד/שכבהובחר בגודל פיקסל y/x בהתאם לגודל הסופי של המונטאז.
הערה: למשל, אם מונטאז צריך להיות סופי באמצעות ארבעה אריחים של 4,096 x 4,096 פיקסלים, גודל הבד צריך להיות לפחות 8,192 x 8,192 פיקסלים. שקול לעשות את זה קצת יותר גדול, ולחתוך אותו מאוחר יותר. - כופה על החלקים המשותפים של אריחים בודדים על-ידי גרירה ושחרורם בערכת השכבות. השתמש במחוון השמאלי העליון כדי לשנות את השקיפות כדי לסייע בסידור הסופרפוזיציה.
- מונטאז ' ומיישר את הערימות על-ידי לחיצה על לחצן העכבר הימני ≫ ישרולאחר מכן בחר אחת מהאפשרויות (ראה הערה להלן).
הערה: SBEM או פרפור-SEM הם בדרך כלל מיושרים היטב, אך מוטעה מינורי עלול להתרחש. יישור שכבות הוא קו הצינור האוטומטי עבור יישור z ; מונטאז ' שכבות מרובות הוא צינור אוטומטי ליישור אריחים על כל מחסנית z , עבור כל אמצעי האחסון; יישור פסיפס רב-שכבתי משלב בין שתי האפשרויות הקודמות. פעולה זו גוזלת זמן וכפופה לזיכרון הגישה האקראית (RAM) של המחשב. שקול להשתמש במחשב high-end ולתת לו לפעול במשך שעות/ימים, בהתאם לגודל המחסנית. - לבסוף, לייצא את ערימות התמונה ולשמור אותם באמצעות עכבר לחיצה ימנית ≫ להפוך תמונה שטוחה, ולאחר מכן הקפד לבחור את הראשון לתמונה האחרונה בתפריטים הנפתחים התחלה וסיום.
- שימוש בפונקציות מוטבעות TrakEM2, מבני מקטע של עניין במידת הצורך.
- ב-TrakEM2's GUI, לחץ לחיצה ימנית על כל דבר תחת חלון התבנית ובחר בהוסף ילד חדש ≫ Area_list.
- גרור ושחרר כל דבר מעל התיקיה תחת אובייקטים של Project, ואחד הדברים יופיעו שם.
- גרור ושחרר את רשימת האזורים מהתבנית אל כל מה שנמצא תחת אובייקטי פרוייקט.
- באשנב התצוגה של מחסנית התמונה, בחר את שטח Z עם הסמן. רשימת האזורים תופיע, עם מספר זיהוי ייחודי. בחרו בכלי מברשת על הקצה העליון (הימני התחתון) והשתמשו בעכבר כדי לפלח מבנה על-ידי מילוי הציטוסול שלו, על כל מחסנית z .
- יצא את המסיכה המקוטרת כדי להשתמש ב-ilastik כזרע לחריטה על-ידי לחיצה ימנית על אובייקט הרשימה אזור ברשימת הרווחים של Z, או על המסיכה באשנב, ובחר ייצוא > אזור מציג רשימות כתוויות (tif).
- בהתאם לרזולוציה הדרושה לשחזורים נוספים, במידת האפשר, הפחת את גודל הפיקסל של ערימת התמונות באמצעות דגימת הפחתה, בהתחשב בדרישות הזיכרון של התוכנה שישמשו לפילוח ושחזור. השתמש בתמונה > התאם ≫ גודל.
הערה: ilastik מטפל בערימות של עד 500 פיקסלים על xy . בנוסף, הפחתת דגימה תקטין את הרזולוציה של המחסנית; לכן, קח בחשבון את הגודל המינימלי שבו האובייקט עדיין מופיע לזיהוי, ולכן ניתן למחולק. - כדי לשפר את הניגודיות ולסייע לפילוח, ניתן להחיל את המסנן ' הסר חידוד מסיכה ' על מנת להפוך את הקרומים לחומר מצנן. השתמש בתהליך ≫ סנן ≫ הסר חידוד מסיכה.
- יצא את מחסנית התמונה כתמונות בודדות לעיבוד נוסף בתוכנת פילוח, (לדוגמה, ilastik), שימוש בקובץ > שמירה בשם... > רצף תמונות ובחר בתבנית. tif.
2. פילוח (חצי אוטומטי) ושחזור באמצעות ilastik 1.3.2
- ב GUI הראשי, בחר את המודול גילוף .
- טען את ערימת התמונות באמצעות הוספת ≫ חדשה הוספת אמצעי אחסון יחיד תלת-ממדי/4 תלת-ממד מרצף.
- בחר את הספריה כולה ובחר את התיקיה המכילה את מחסנית התמונות שנשמרה כקבצים בודדים. בתחתית החלון החדש, שבו האפשרויות לטעינת התמונות נמצאות, הקפד לשמור על Z נבחר.
- עבור השלבים הבאים, כל הפעולות והלחצנים ניתן למצוא בצד שמאל של GUI התוכנה הראשית. בכרטיסיה ' עיבוד מקדים ', השתמש באפשרויות הסטנדרטיות שכבר נבדקו. השתמש בקווים בהירים (מסנני רידג ') ושמור את קנה המידה של המסנן ב-1.600. ניתן לשנות פרמטר זה לאחר מכן.
- לאחר סיום העיבוד המוגמר, בחרו בעמוד הבא בתפריט הנפתח של מודול התיוג . אובייקט אחד ורקע אחד נמצאים כברירת מחדל.
-
בחר את זרע האובייקט על-ידי לחיצה עליו, וצייר קו מעל מבנה הריבית; לאחר מכן, בחר את זרעי הרקע וצייר שורות אחת או מרובות מחוץ לאובייקט לשחזור. לאחר מכן, לחץ על פלח והמתן.
הערה: בהתאם לעוצמת המחשב ולגודל המחסנית, הפילוח עשוי להימשך ממספר שניות לשעות. ברגע שנעשה זאת, מסיכה שקופה למחצה המדגיש את הפילוח אמור להופיע על גבי המבנה המקולא.- גלול בערימה כדי לבדוק את הפילוח. הפילוח עשוי לא להיות מדויק ולא לעקוב אחר מבנה הריבית במדויק או לשפוך ממנו. תקן את כל הגלישה על-ידי הצבת זרעי רקע על הפילוח הנשפך, והוסף זרע אובייקט על המקטע הלא משוחזר של אובייקט הריבית.
- אם הפילוח עדיין אינו נכון, נסה לשנות את הפרמטר הטיה , שיגדיל או יקטין את כמות הפיקסלים המסווגים שאינם ברורים כפי שמקובל. הערך שלו הוא 0.95 כברירת מחדל; הפחת אותו כדי להגביל את הגלישה (בדרך כלל לא פחות מ-0.9) או להגדיל אם הפילוח שמרני מדי (עד 1).
- אפשרות נוספת היא לחזור לשלב 2.4 (על-ידי לחיצה על קדם-עיבוד) וכלה בשינוי גודל המסנן; להגדיל את הערך (למשל, כדי 2) יהיה למזער את האפקטים מלח ופלפל כמו רעש, אבל גם להפוך את הקרומים יותר מטושטש יותר ויותר פרטים קטנים יותר לזהות. הדבר עשוי להגביל את הגולש.
- חזור על הזמן ככל הנדרש, כל עוד האובייקטים הרצויים מחולקים. לאחר סיום האובייקט, לחץ על שמור את האובייקט הנוכחי, מתחת לפלח. שני זרעים חדשים יופיעו, כדי להתחיל בפילוח של אובייקט חדש.
- לחלץ רשתות שינוי של פני השטח מיד כקבצי אובייקטים על ידי לחיצה על ייצוא כל רשתות שינוי.
- אם יש צורך בהגהה נוספת, ניתן לחלץ פילוח כמסיכות בינאריות. בחר במסיכה כדי לייצא אותה על-ידי לחיצה על עיון באובייקטים; לאחר מכן, לחץ לחיצה ימנית על פילוח ≫ ייצוא ולאחר מכן, תחת פרטי קובץ פלט, בחר ברצף tif כתבנית.
3. הגהה/פילוח (ידני) בTrakEM2 (פיג'י)
- טען את מחסנית התמונה וצור פרוייקט TrekEM2 חדש לפי שלב 1.6.1.
- יבא את המסיכות הזקוקות להגהה באמצעות האפשרות ' ייבוא תוויות ' כאריאליסטים, הזמינים באותו תפריט ייבוא המשמש לייבוא מחסנית התמונה.
- בחר את האריליסט המיובא במרחב Z והשתמש בכלי מברשת כדי לסקור את הפילוח.
- המחש את הדגם בתלת-ממד על-ידי לחיצה ימנית ברשימת האזורים ≫ הצג ב-3d. בחלון הבא המבקשת מספר דגימה מעלה, ערך גבוה יותר יפיק רשת שינוי רזולוציה נמוכה יותר.
הערה: בהתאם לגודל האובייקט, שקול להשתמש בערך בין 4 ל-6, אשר בדרך כלל נותן את הפשרה הטובה ביותר בין רזולוציה לבין פרטים מורפולוגיים. - יצא את רשת השינוי התלת-ממדית כחזית גל. אובייקט על-ידי בחירה מתוך קובץ התפריט ≫ ייצוא משטחים ≫ חזית גל.
4. ניתוח תלת מימד
- פתח בלנדר. במהלך השלבים הבאים, הקפד להתקין את ערכת הכלים העצבית (זמינה ב-https://neuromorph.epfl.ch/index.html) ואת ערכת הכלים לניתוח הגליקוגן (זמינה ב-https://github.com/daniJb/glyco-analysis).
- יבא את האובייקטים באמצעות ייבוא האצווה העצבי באמצעות לחיצה על יבא אובייקטים תחת התפריט סצנה , כדי לייבא אובייקטים מרובים בו. הקפד להפעיל את השימוש בשינוי מחדש ובהצללה חלקה.
הערה: לא מומלץ ללחוץ על סיום השינוי מחדש אם קיים חוסר ודאות לגבי הגודל ההתחלתי של האובייקט. עומק עץ ייבוא בערך 7 (ברירת המחדל) הוא בדרך כלל טוב לשמור על רזולוציה מקובלת ומורפולוגיה של האובייקט. - בחר את אובייקט הריבית מהאניה ושנה את עומק ה-octree של הפונקציה remesh תחת תפריט המשנים מחדש כדי למזער את מספר הקודקודים וכיצד להימנע מאיבוד פרטים ברזולוציה ובמבנה המדויק. בעת שינוי עומק האוקטטרי, הרשת על GUI הראשי תשתנה בהתאם. לאחר סיום, לחץ על החל כדי לסיים את התהליך.
הערה: ערכים סביב 4 הם בדרך כלל טוב לאובייקטים קטנים (כגון צפיפויות פוסט סינפטית), ערכים סביב 7 עבור גדולים יותר (כגון אקסונים ארוך או דנדריטים), ערכים סביב 8 או 9 עבור מורפולוגיות הסלולר המלא שבו פרטים של רזולוציות שונות צריך להיות תוחזק. - השתמש בכלי השימוש בתמונות של מחסנית תמונות בלוח השמאלי, תחת התפריט עצבי , כדי לטעון את מחסנית התמונה. הקפד להזין את הגודל הפיזי של מחסנית התמונה עבור x, yו- x (ב מיקרון או nanometers, בהתאם ליחידות של רשת השינוי) ולבחור את הנתיב של הערימה על ידי לחיצה על Source_Z. X ו-Y הם מטוסים אורתוגונאליות; הם אופציונליים וייטענו רק אם המשתמש יוסיף נתיב חוקי.
- לאחר מכן, בחר רשת שינוי באשנב על-ידי לחיצה ימנית עליו, הזן את מצב העריכה על-ידי לחיצה על Tab, בחר אחד (או יותר) קודקודים באמצעות העכבר הימני לחץ, ולבסוף, לחץ על הצג תמונה בקודקוד. אחד (או יותר) מטוס חתוך עם המיקרו-גרף יופיע על גבי רשת השינוי.
- בחר במישור החתוך על-ידי לחיצה ימנית עליו, הקש Ctrl + Yוגלול מעל דגם התלת-ממד באמצעות גלילת העכבר. ניתן להשתמש באפשרות זו גם כשיטת הגהה.
- השתמש בכלי מדידה עבור כימות של אזורי שטח, אמצעי אחסון ואורכי. מבצעים אלה מתועדים בפרטים נוספים מאת Jorstad et al.19 ובאתר כעצבי24.
- השתמש בכלי ניתוח הגליקוגן כדי לכמת את הקירבה הגליקוגן לעבר שפני השמש ובוטון. פעולות מתועדות בעוד פרטים בפרסום הקודם10 ובמאגר ניתוח הגליקוגן25.
- יבא את האובייקטים באמצעות ייבוא האצווה העצבי באמצעות לחיצה על יבא אובייקטים תחת התפריט סצנה , כדי לייבא אובייקטים מרובים בו. הקפד להפעיל את השימוש בשינוי מחדש ובהצללה חלקה.
- הפעל גלאם23. הקוד, קובץ ההפעלה, וחלק מקבצי הבדיקה זמינים במאגר גלאם26.
- הכן שני קבצי גיאומטריה בתבנית. רובדי: קובץ מקור אחד המכיל גרגרי גליקוגן וקובץ יעד אחד המכיל את משטחי המבנה.
- הכינו שלושה קבצי מיפוי צבעי ascii (כל שורה המכילה t_norm (0. .1) R (0.. 255) G (0...) (0.. 255)) לייצוג ערכי קליטה מקומיים, ערכי שיא וערכי ספיגה ממוצעים.
- הפעל את הסקריפט ב-C++, עם קובצי הגיאומטריה (step 4.2.1) וקובצי מפת צבעים (שלב 4.2.2), על-ידי הגדרת רדיוס ההשפעה (במיקרון), ערך הספיגה הצפוי המקסימלי, וכן סף מנורמל לקיבוץ האשכולות של פסגות הקליטה. לקבלת מידע אודות פרמטרים אחרים, הפעל את קובץ ה-script באמצעות האפשרות-help.
- יצא את התוצאות כקבצי. רובדי או אובייקט אובייקטים: אובייקטי היעד ממופים באמצעות ערכי גלאם, סמני שיא הקליטה מיוצגים כספירות בצבעים מסומנים, ואובייקטי היעד מקודדים לצבע ביחס לערך הקליטה הממוצע.
- פתח את האינטראקציה של נתוני VR. VR נתונים אינטראקציה-קוד הפעלה זמין במאגר ציבורי27.
- ייבוא רשתות שינוי להיות דמיינו, בעקבות ההוראות בתפריט VR. הקפד לייבא את קבצי. אובייקטים שחושבו בשלב 4.2.1, במקרה שיהיה צורך בניתוח גלאם.
Representative Results
על-ידי שימוש בהליך המוצג לעיל, אנו מציגים תוצאות על שתי ערימות תמונה בגדלים שונים, כדי להדגים כיצד הגמישות של הכלים מאפשרת לשנות את התהליך לערכות נתונים גדולים יותר. במקרה זה, two 3dem מערכות הנתונים הם (i) P14 עכברוש, קליפת המגע, שכבה VI, 100 יקרומטר x 100 יקרומטר x 76.4 יקרומטר4 ו (ii) P60 עכברוש, היפוקמפוס CA1, 7.07 יקרומטר x 6.75 יקרומטר x 4.73 יקרומטר10.
ניתן לבצע את פעולות העיבוד המקדימות (איור 1) באותו אופן עבור שתי קבוצות הנתונים, פשוט לקחת בחשבון שערכת נתונים גדולה יותר, כגון המחסנית הראשונה, שהיא 25 GB, מחייבת היתר ביצוע חומרה כדי לטפל בהדמיה ובעיבוד נתונים גדולים . המחסנית השניה היא רק 1 ג'יגה-בתים, עם גודל איזוטרופי מושלם.
ייתכן שגודל הנתונים אינו קשור ישירות לשדה התצוגה (FOV), במקום לרזולוציה של המחסנית עצמה, התלויה בגודל הפיקסלים המרבי של החיישן של המיקרוסקופ ובהגדלה של המחסנית. בכל מקרה, לוגית, FOVs גדול יותר צפויים לכבוש שטח פיזי יותר לעומת FOVs קטן יותר, אם נרכש באותה רזולוציה.
ברגע שאוסף התמונות מיובא, כפי שמצוין בסעיף 1 של הפרוטוקול, בתוכנת פיג'י (איור 1a), שחרור מדעי של imagej12, נקודה חשובה אחת היא לוודא שתבנית התמונה היא 8 סיביות (איור 1a). זה בגלל תוכנה רכישה רבים מיקרוסקופיה חברות מפיקי ליצור תבנית קניינית שלהם בפורמט 16-bit כדי לאחסן מטא-נתונים רלוונטיים למידע על תהליך הרכישה (כלומר, גודל פיקסל, עובי, זרם/מתח של ה קרן אלקטרון, לחץ בתאי) יחד עם מחסנית תמונה. התאמות כאלה מאפשרות למדענים לחסוך בזיכרון, מכיוון שבשמונה הסיביות הנוספות המכילות את המטא-נתונים אין השפעה על התמונות. הפרמטר החשוב השני כדי לבדוק הוא גודל voxel, אשר לאחר מכן מאפשר שחזור בעקבות פילוח להתבצע בקנה מידה הנכון (מיקרומטר או nanometers; איור 1B).
ערימות עשויות להזדקק ליישור או לתפרים אם הם נרכשו באמצעות ריצוף; פעולות אלה ניתן לבצע בתוך TrakEM2 (איור 2A), למרות לגבי היישור, טכניקות 3dem אוטומטי כמו פרפור-SEM או 3dem הם בדרך כלל טוב ינה.
שלב אחרון מחייב סינון וכנראה, דגימת הפחתה של המחסנית, בהתאם לאובייקטים שיש לשחזר והאם הפחתת דגימה משפיעה על ההכרה בתכונות של הניתנים לשחזור. למשל, עבור מחסנית גדולה יותר (של הקליפה הסוחושי של חולדות P14), לא ניתן היה להתפשר על הרזולוציה לטובת יעילות השיקום, ואילו עבור מחסנית קטנה יותר (של ההיפוקמפוס CA1 של P60 חולדות), זה היה אפשרי לעשות זאת מכיוון שהרזולוציה הייתה הרבה מעל מה שהיה דרוש כדי שהעצמים הקטנים ביותר יהיו משוחזרים. לבסוף, השימוש במסכה לחידוד מגביר את ההפרש בין הקרומים לרקע, מה שהופך אותו לחיובי עבור שחזורים של תוכנה כמו ilastik אשר משתמש מעברי צבע כדי להעריך מראש גבולות.
בעקבות עיבוד תמונה, ניתן לבצע שחזור באופן ידני באמצעות TrakEM2, או למחצה באופן אוטומטי באמצעות ilastik (איור 2C). ערכת נתונים כמו הקטנה יותר מפורטת כאן (ii), כי ניתן להוריד דגימה כדי להתאים לזיכרון, יכול להיות מקוטע באופן מלא באמצעות ilastik (איור 2B) כדי לייצר שחזור צפוף. במקרה של ערכת הנתונים הראשונה המופיעה כאן (i), הצלחנו לטעון ולעבד מראש את ערכת הנתונים כולה עם תחנת עבודה של לינוקס עם 500 GB של זיכרון RAM. מפלח דליל של 16 מורפולוגיות מלא הושג עם צינור היברידי, על ידי חילוץ מקטעי מחוספס שהיה להגיה ידנית באמצעות TrakEM2.
ניתוח תלת מימד של תכונות כמו פני שטח, אמצעי אחסון, או התפלגות של הגליקוגן תאיים ניתן לבצע בתוך סביבת בלנדר (איור 3) באמצעות קודים מותאמים אישית, כגון עצבי19 או ניתוח גליקוגן10.
במקרה של מערכות נתונים המכילים גרגרי גליקוגן כמו גם, ניתוח על ההפצה שלהם ניתן להסיק באמצעות גלאם, קוד C++ שיפיק מפות צבעוניות עם אזור השפעה ישירות על הרשת.
לבסוף, מערכות נתונים מורכבות כאלה ניתן לדמיין וניתח באמצעות VR, אשר הוכח להיות שימושי עבור ניתוח של datasets עם תצוגה מסוימת סגר (איור 4). למשל, פסגות שהסיק ממפות גלאם הגיעו בקלות ויזואלית מדנדטים בערכת הנתונים השנייה שנדונה כאן.
איור 1: עיבוד תמונה והכנה לפילוח תמונה. (א) מהגיהראשי של פיג'י. (ב) לדוגמה של תמונות מוערמות מערכת נתונים (i) שנדונו בתוצאות הנציגים. החלונית מימין מציגה מאפיינים המאפשרים למשתמש להגדיר את גודל voxel. (ג) דוגמה לפעולת פילר ושינוי גודל המוחלת על תמונה בודדת. הלוחות שבצד ימין מציגים הגדלה ממרכז התמונה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: פילוח ושחזור באמצעות TrakEM2 ו ilastik. (א) TrakEM2 GUI עם אובייקטים מחולק ידנית (באדום). (ב) המסיכה המיוצאת מהחלונית a יכולה לשמש כקלט (seed) עבור פילוח אוטומטי למחצה (c). מ ilastik, מסכות (אדום) ניתן לייצא עוד TrakEM2 עבור הגהה ידנית. (ד) מסיכות ניתן לייצא כרשתות שינוי משולשים תלת-ממדיים כדי לחשוף מבנים משוחזרים. בדוגמה זו, ארבעה נוירונים, אסטרוציטים, microglia, ו קרום הלב מתוך הנתונים (i) (הנדונים בתוצאות הנציגים) שוחזרו באמצעות תהליך זה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ניתוח תלת מימד של מורפולוגיות שעברו שחזור באמצעות כלים מותאמים אישית. (a) נפח התמונה איזוטרופי מפרפור-ערכת נתונים של SEM (ii) (כפי שמתואר בתוצאות הנציג). (ב) שחזורצפוף מלוח a. אפור = אקטונים; ירוק = תהליך אסטרוציטוטי; כחול = דנדטים. (ג) micrograph מציג דוגמאות של מטרות עבור כימות כגון הסינפסות (ערכת נתונים (i)) וגרגרי הגליקוגן astrocytic ((2)) בתוך המאגציות הנכונות. (ד) מסכה מלוח c המציגה את התפלגות גרגרי הגליקוגן סביב הסינפסות. (ה) קוונפיקציה של התפלגות הגליקוגן מערכת הנתונים מלוח c, באמצעות ארגז הכלים של ניתוח הגליקוגן מבלנדר. קווי השגיאה מציינים שגיאות סטנדרטיות. N = 4,145 גרגרי הגליקוגן. (ו) איור גרפי של הדמיית הקלט והפלט של גלאם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: ניתוח ב-VR. (א) משתמש הלובש אוזניית VR תוך כדי עבודה על (ב) שחזור צפוף מערכת נתונים של פרפור-SEM (ii) (כפי שמתואר בתוצאות הנציגים). (ג) מקיפה קטע VR מקבוצת המשנה של neurites מ לוח b. הלייזר הירוק מצביע על שיא גלאם. (ד) דוגמה לניתוח מהשיא של גלאם ב-VR. N = 3 עכברים לכל אחד מהעמודות. ניתוח של פרפור-SEM מתוך פרסום קודם28. קווי השגיאה מציינים את השגיאות הסטנדרטיות; *p < 0.1, בכיוון אחד ANOVA. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Discussion
השיטה שהוצגה כאן היא מדריך שימושי צעד אחר צעד עבור פילוח ושחזור תלת-ממד של ערכת נתונים מרובת-מידה של EM, בין אם הם באים מטכניקות דימות ברזולוציה גבוהה, כמו פרפור-SEM, או הפרדה סדרתית אוטומטית אחרים וטכניקות הדמיה. פרפור-SEM יש את היתרון של להגיע איזוטרופיות מושלמת בגודל voxel על ידי גזירה סעיפים רזה כמו 5 ננומטר באמצעות קרן יון ממוקדת, fov שלה עשוי להיות מוגבל 15-20 יקרומטר בגלל חפצים בצד, אשר עשויים להיות בשל התצהיר של רקמת לחתוך אם FO V חורג מערך זה. ממצאים כאלה ניתן להימנע באמצעות טכניקות אחרות, כגון SBEM, אשר משתמשת סכין יהלום לגזור סעיפים סדרתיים בתוך תא המיקרוסקופ. במקרה זה, החלטה z יכול להיות בסביבות 20 ננומטר במצב הטוב ביותר (בדרך כלל, 50 nm), אבל fov יכול להיות גדול יותר, למרות הרזולוציה פיקסל צריך להיות בסכנה עבור אזור רחב של עניין. פתרון אחד כדי להתגבר על מגבלות כאלה (הגדלה לעומת FOV) היא לחלק את אזור העניין באריחים ולרכוש כל אחד מהם ברזולוציה גבוהה יותר. הצגנו כאן תוצאות של מחסנית SBEM-dataset (i) בתוצאות הנציג-ומחסנית פרפור-SEM-dataset (ii) בתוצאות הנציג.
כמו הדור של מערכות נתונים גדולים יותר וגדולים יותר הופך נפוץ יותר ויותר, המאמצים ביצירת כלים לסיווג פיקסל מקטעי תמונה אוטומטית מתרבים; עם זאת, עד היום, שום תוכנה לא הוכיחה אמינות דומה לזה של הגהה אנושית, ולכן עדיין הכרחי, לא משנה עד כמה זה זמן רב. באופן כללי, ערכות נתונים קטנות יותר שניתן להוריד בדגימה, כמו במקרה של ערכת נתונים (ii), יכולות להיות משוחזרים בצפיפות על-ידי משתמש יחיד ומומחה בשבוע, כולל זמן הגהה.
הפרוטוקול המוצג כאן כרוך בשימוש בשלוש תוכניות תוכנה בפרט: פיג'י (גירסה 2.0.0-rc-65/1.65 b), ilastik (גרסה 1.3.2 rc2), ו בלנדר (2.79), שהם כל הקוד הפתוח, multi-פלטפורמות תוכניות ולהורדה בחינם. פיג'י הוא שחרור של ImageJ, מופעל על ידי תוספים לניתוח תמונה ביולוגית. יש לו ארכיטקטורת תוכנה חזקה והוא הציע כפי שהיא פלטפורמה נפוצה עבור מדעני החיים וכולל TrakEM2, אחד התוספים הראשונים והנפוצים ביותר עבור פילוח תמונה. בעיה אחת מנוסה על ידי משתמשים רבים לאחרונה הוא המעבר מ-Java 6 ל-Java 8, אשר יוצר בעיות תאימות; לכן, אנו ממליצים להימנעות מעדכון ל-Java 8, אם אפשר, כדי לאפשר לפיג לפעול כראוי. אילאסטיק היא תוכנה רבת עוצמה המספקת מספר מסגרות לסיווג פיקסל, כל אחד מתועד והסביר באתר שלהם. מודול גילוף המשמש למחצה אוטומטי פילוח של ערימות EM הוא נוח כפי שהוא חוסך זמן רב, המאפשר למדענים להפחית את הזמן בילה על עבודה ידנית מחודשים לימים עבור משתמש מנוסה, כמו עם לחיצה אחת שלמה neurite יכול להיות מחולק בשניות. שלב טרום העיבוד הוא אינטנסיבי מאוד מנקודת המבט של חומרה, וערכות נתונים גדולות מאוד, כמו מחסנית sbem המוצגת כאן, אשר היה 26 GB, דורשים אסטרטגיות משונות כדי להתאים לזיכרון, בהתחשב בכך שאחד לרכוש ערכת נתונים גדולה משום שאין אפשרות ל שדה הפשרה של תצוגה ורזולוציה. לכן, ייתכן שדגימת הפחתה אינה פתרון מתאים במקרה זה. המהדורה האחרונה של התוכנה יכול לעשות preprocessing בתוך כמה שעות עם תחנת עבודה רבת עוצמה לינוקס, אבל פילוח ייקח דקות, גלילה דרך המחסנית עדיין יהיה איטי יחסית. אנו עדיין משתמשים בשיטה זו לפילוח ראשוני ומחוספס, ולהגיה אותה באמצעות TrakEM2. לבסוף, בלנדר הוא תוכנת דוגמנות 3D, עם עוצמה 3D מנוע עיבוד, אשר ניתן להתאים אישית עם סקריפטים פיתון שניתן להטביע GUI הראשי כמו הרחבות, כגון ניתוח עצבי והגליקוגן. הגמישות של תוכנה זו מגיעה עם החיסרון, כי בניגוד לפיג, למשל, הוא אינו מיועד להדמיה מקוונת של ערכות נתונים גדולות; לכן, המחשה וניווט באמצעות רשתות שינוי גדולות (מעל 1 ג'יגה-בתים) עשויה להיות איטית ולא יעילה. בגלל זה, תמיד מומלץ לבחור טכניקות להפחית את מורכבות הרשת אבל הם זהירים לא לשבש את המבנה המקורי של מבנה העניין. הפונקציה remesh מגיע שימושי והוא תכונה מוטבעת של כלי הייבוא של האצווה הנוירוורפולוגיה. בעיה עם פונקציה זו היא, בהתאם למספר הקודקודים של רשת השינוי המקורית, ערך העומק octree, הקשור לרזולוציה הסופית, צריך להיות משתנה בהתאם. ניתן לשפוך עצמים קטנים בעומק מוקטן קטן (כגון 4), אך אותו ערך עשוי לשבש את המבנה של עצמים גדולים יותר, הזקוקים לערכים גדולים יותר (6 לכל היותר, ל -8 או אפילו 9 עבור רשת גדולה מאוד, כגון תא מלא). מומלץ להפוך תהליך זה לאיטרטיבי ולבדוק את העומקים השונים של האוקטטרי אם גודל האובייקט אינו ברור.
כפי שהוזכר קודם לכן, היבט אחד שיש לקחת בחשבון הוא הכוח החישובית להיות מוקדש לשחזור וניתוח, הקשורים לתוכנה הנמצאת בשימוש. כל הפעולות המוצגות בתוצאות הנציג של כתב היד הזה הושגו באמצעות MacPro, מצויד כרטיס גרפי של AMD FirePro D500, 64 GB של זיכרון RAM, ו-CPU Intel Xeon E5 עם 8 ליבות. לפיג יש ארכיטקטורת תוכנה טובה לטיפול בערכות נתונים גדולות; לכן, מומלץ להשתמש במחשב נישא עם ביצועי חומרה טובים, כגון MacBook Pro עם 2.5 GHz Intel i7 CPU ו -16 GB של זיכרון RAM. תוכנת ilastik תובענית יותר במונחים של משאבי חומרה, בפרט במהלך שלב העיבוד הקדם. למרות הפחתת הדגימה של מחסנית התמונה היא תכסיס טוב כדי להגביל את בקשות החומרה מהתוכנה ומאפשרת למשתמש לעבד מחסנית עם מחשב נישא (בדרך כלל אם הוא מתחת 500 פיקסלים ב- x,y,z), אנו מציעים שימוש באיכות גבוהה מחשב כדי להפעיל תוכנה זו בצורה חלקה. אנו משתמשים בתחנת עבודה מצויד עם מעבד Intel Xeon זהב 6150 עם 16 ליבות ו 500 GB של זיכרון RAM.
כאשר מסופק עם שחזור מדויק 3D, מדענים יכולים להיפטר מיקרוגרפים המקורי ולעבוד ישירות על דגמי תלת-ממד כדי לחלץ נתונים שימושיים מורמטרים שימושי כדי להשוות תאים מאותו סוג, כמו גם סוגים שונים של תאים, ולנצל VR עבור הערכות איכותיות וכמותיים של מורפולוגיות. בפרט, השימוש האחרון הוכיחה להיות מועיל במקרה של ניתוחים של מורפולוגיות צפוף או מורכבים הנוכחים חסימה חזותית (כלומר, חסימה של מושא עניין במרחב התלת-ממדי על ידי אחד שני ממוקם בין המתבונן לבין fi אובייקט ראשון), מה שמקשה לייצג ולנתח אותם ב-3D. בדוגמה שהוצגה, משתמש מנוסה לקח בערך 4 שעות שאינן רצופות כדי להתבונן בערכות הנתונים ולספור את האובייקטים. הזמן המושקע בניתוח VR עשוי להשתנות כהיבטים כמו מחלת VR (אשר יכול, במידה מסוימת, להיות קשור מחלת המכונית) יכול להיות השפעה שלילית על חווית המשתמש; במקרה זה, המשתמש עשוי להעדיף כלי ניתוח אחרים ולהגביל את זמנם המוקדש ל-VR.
לבסוף, ניתן להחיל את כל השלבים הללו על טכניקות אחרות של מיקרוסקופ ושלא EM, היוצרות ערימות של תמונות. EM יוצר תמונות כי הם, באופן כללי, מאתגרת להתמודד ולפלח, לעומת, למשל, מיקרוסקופ פלואורסצנטית, שבו משהו דומה למסיכה בינארית (אות לעומת רקע שחור), כי בעיקרון ניתן לעבד בקלות ב-3D עבור עיבוד נוסף, יש לעתים קרובות צריך לטפל.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי אוניברסיטת עבדאללה המלך המדע והטכנולוגיה (KAUST) מענקי מחקר תחרותי (CRG) מענק "KAUST הברית BBP לדגמי אינטגרטיבי של מטבוליזם אנרגיה המוח" כדי P.J.M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fiji | Open Source | 2.0.0-rc-65/1.65b | Open Source image processing editor www.fiji.sc |
| iLastik | Open Source | 1.3.2 rc2 | Image Segmentation tool www.ilastik.org |
| Blender | Blender Foundation | 2.79 | Open Source 3D Modeling software www.blender.org |
| HTC Vive Headset | HTC | Vive / Vive Pro | Virtual Reality (VR) Head monted headset www.vive.com |
| Neuromorph | Open Source | --- | Collection of Blender Addons for 3D Analysis neuromorph.epfl.ch |
| Glycogen Analysis | Open Source | --- | Blender addon for analysis of Glycogen https://github.com/daniJb/glyco-analysis |
| GLAM | Open Source | --- | C++ Code For generating GLAM Maps https://github.com/magus74/GLAM |
References
- Leighton, S. B. SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM - a technical note. Scanning Electron Microscopy. , 73-76 (1981).
- Knott, G., Marchman, H., Wall, D., Lich, B. Serial section scanning electron microscopy of adult brain tissue using focused ion beam milling. Journal of Neuroscience. 28, 2959-2964 (2008).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLOS Biology. 2, e329 (2004).
- Coggan, J. S., et al. A Process for Digitizing and Simulating Biologically Realistic Oligocellular Networks Demonstrated for the Neuro-Glio-Vascular Ensemble. Frontiers in Neuroscience. 12, (2018).
- Tomassy, G. S., et al. Distinct Profiles of Myelin Distribution Along Single Axons of Pyramidal Neurons in the Neocortex. Science. 344, 319-324 (2014).
- Wanner, A. A., Genoud, C., Masudi, T., Siksou, L., Friedrich, R. W. Dense EM-based reconstruction of the interglomerular projectome in the zebrafish olfactory bulb. Nature Neuroscience. 19, 816-825 (2016).
- Kasthuri, N., et al. Saturated Reconstruction of a Volume of Neocortex. Cell. 162, 648-661 (2015).
- Calì, C., et al. The effects of aging on neuropil structure in mouse somatosensory cortex—A 3D electron microscopy analysis of layer 1. PLOS ONE. 13, e0198131 (2018).
- Visual Analysis of Glycogen Derived Lactate Absorption in Dense and Sparse Surface Reconstructions of Rodent Brain Structures. Calì, C., Agus, M., Gagnon, N., Hadwiger, M., Magistretti, P. J. Eurographics Italian Chapter Conference 2017 – Smart Tools and Apps in computer Graphics, , Catania, Italy. (2017).
- Calì, C., et al. Three-dimensional immersive virtual reality for studying cellular compartments in 3D models from EM preparations of neural tissues. Journal of Comparative Neurology. 524, 23-38 (2016).
- Fiala, J. C. Reconstruct: a free editor for serial section microscopy. Journal of Microscopy. 218, 52-61 (2005).
- Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLOS ONE. 7, e38011 (2012).
- Januszewski, M., et al. High-precision automated reconstruction of neurons with flood-filling networks. Nature Methods. 1, (2018).
- Shahbazi, A., et al. Flexible Learning-Free Segmentation and Reconstruction of Neural Volumes. Scientific Reports. 8, 14247 (2018).
- Sommer, C., Straehle, C., Köthe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro, Chicago, IL, , (2011).
- Holst, G., Berg, S., Kare, K., Magistretti, P., Calì, C. Adding large EM stack support. 2016 4th Saudi International Conference on Information Technology (Big Data Analysis) (KACSTIT), Riyadh, Saudi Arabia, , (2016).
- Beyer, J., et al. ConnectomeExplorer: query-guided visual analysis of large volumetric neuroscience data. IEEE Transactions on Visualization and Computer Graphics. 19, 2868-2877 (2013).
- Beyer, J., et al. Culling for Extreme-Scale Segmentation Volumes: A Hybrid Deterministic and Probabilistic Approach. IEEE Transactions on Visualization and Computer. , (2018).
- Jorstad, A., et al. NeuroMorph: A Toolset for the Morphometric Analysis and Visualization of 3D Models Derived from Electron Microscopy Image Stacks. Neuroinformatics. 13, 83-92 (2015).
- Jorstad, A., Blanc, J., Knott, G. NeuroMorph: A Software Toolset for 3D Analysis of Neurite Morphology and Connectivity. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 59 (2018).
- Calì, C.
- Mohammed, H., et al. Abstractocyte: A Visual Tool for Exploring Nanoscale Astroglial Cells. IEEE Transactions on Visualization and Computer Graphics. , (2017).
- Agus, M., et al. GLAM: Glycogen-derived Lactate Absorption Map for visual analysis of dense and sparse surface reconstructions of rodent brain structures on desktop systems and virtual environments. Computers & Graphics. 74, 85-98 (2018).
- École Polytechnique Fédérale de Lausanne. NeuroMorph Analysis and Visualization Toolset. , http://neuromorph.epfl.ch (2018).
- Boges, D. GitHub - daniJb/glycol-analysis: Glycogen_analysis.py is a python-blender API based script that performs analysis on a reconstructed module of glycogen data. , https://github.com/daniJb/glyco-analysis (2018).
- Agus, M. GitHub – magus74/GLAM: Glycogen Lactate Absorption Model. , https://github.com/magus74/GLAM (2019).
- Agus, M., et al. GLAM: Glycogen-derived Lactate Absorption Map for visual analysis of dense and sparse surface reconstructions of rodent brain structures on desktop systems and virtual environments. Dryad Digital Repository. , (2018).
- Calì, C., et al. Data from: The effects of aging on neuropil structure in mouse somatosensory cortex—A 3D electron microscopy analysis of layer 1. Dryad Digital Repository. , (2018).
