Summary

Улучшение прививки человека индуцированных Плюрипотентные стволовые клетки полученных кардиомиоцитов через переходный ингибирование Деятельности Ро Киназы

Published: July 10, 2019
doi:

Summary

В этом протоколе мы демонстрируем и подробно о том, как использовать искусственные плюрипотентные стволовые клетки человека для диффериоцитной дифференциации и очистки, и далее, о том, как улучшить его эффективность трансплантации с ингибитором родо-синазы, связанных с Ро-ассоциированным предварительной обработки в модели инфаркта миокарда мыши.

Abstract

Решающим фактором в повышении эффективности клеточной терапии для регенерации миокарда является безопасное и эффективное увеличение скорости прививок клеток. Y-27632 является очень мощным ингибитором Rho-связанных, скручивания,содержащих белок киназы (RhoA/ ROCK) и используется для предотвращения диссоциации индуцированной клеточной апоптозы (anoikis). Мы демонстрируем, что Y-27632 предлечения для человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных кардиомиоцитов (hiPSC-CMsЗРИ) до имплантации приводит к улучшению скорости клеток при в мышиной модели острого инфаркта миокарда (MI). Здесь мы описываем полную процедуру дифференциации hiPSC-CMs, очищения и клеточной предобработки с помощью Y-27632, а также результирующее сокращение клеток, временные измерения кальция и трансплантацию в мышиные модели MI. Предлагаемый метод обеспечивает простой, безопасный, эффективный и недорогой метод, который значительно увеличивает скорость прививок клеток. Этот метод не может быть использован только в сочетании с другими методами для дальнейшего повышения эффективности трансплантации клеток, но и обеспечивает благоприятную основу для изучения механизмов других сердечных заболеваний.

Introduction

Стволовые клетки на основе терапии показали значительный потенциал в качестве лечения сердечного повреждения, вызванного MI1. Использование дифференцированных HIPSCs обеспечивает неисчерпаемый источник hiPSC-CMs2 и открывает двери для быстрого развития прорыв лечения. Тем не менее, многие ограничения на терапевтический перевод остаются, в том числе проблема сильно низкой скорости прививок имплантированных клеток.

Диссоциирующая клетка с трипсином инициирует anoikis3, который только ускоряется, как только эти клетки вводят сявок в суровые среды, такие как ишемический миокард, где гипоксическая среда ускоряет курс к смерти клеток. Из оставшихся клеток значительная часть вымывается из места имплантации в кровоток и распространяется по всей периферии. Одним из ключевых апоптотических путей является путьRhoA/ROCK 4. Основываясь на предыдущих исследованиях, RhoA / ROCK путь регулирует актина цитоскелетной организации5,6, который отвечает за дисфункцию клеток7,8. Ингибитор ROCK Y-27632 широко используется при соматической и стволовой клетке диссоциации и прохода, чтобы увеличить слипания клеток и уменьшить апоптоз клеток9,10,11. В этом исследовании, Y-27632 используется для лечения hiPSC-CMs до трансплантации в попытке увеличить скорость прививования клеток.

Было установлено несколько методов, направленных на улучшение скорости прививок клеток, таких как тепловой шок и мембранное матримальное покрытие подвала12. Помимо этих методов, генетические технологии могут также способствовать пролиферации кардиомиоцитов13 или обратить вспять немиокардиальные клетки в кардиомиоциты14. С точки зрения биоинженерии, кардиомиоциты посеяны на биоматериал эшафот для повышения эффективности трансплантации15. К сожалению, большинство из этих методов являются сложными и дорогостоящими. Напротив, предложенный здесь метод прост, экономичен и эффективен, и его можно использовать как базальное лечение до трансплантации, так и в спряжении с другими технологиями.

Protocol

Все процедуры для животных в этом исследовании были одобрены Институциональным Комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) Университета Алабамы в Бирмингеме и были основаны на Национальных институтах здравоохранения лабораторных животных уход и использование Руководящих п…

Representative Results

HIPSC-CMs, используемые в этом исследовании, были получены из человеческого происхождения с геном репортера люциферазы; Таким образом, выживаемость пересаженных клеток in vivo была обнаружена с помощью биолюминесценционной визуализации (BLI)17 (рисуно?…

Discussion

Ключевыми шагами этого исследования являются получение чистого hiPSC-CMs, повышение активности hiPSC-CMs через предварительное лечение Y-27632 и, наконец, пересадка точного количества hiPSC-CMs в модель мыши MI.

Ключевые вопросы, которые были рассмотрены здесь, были в том, что, во-первых, …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы благодарят д-ра Джозефа К. Ву (Стэнфордский университет) за любезное предоставление конструкции Fluc-GFP и д-ра Янвена Лю за отличную техническую помощь. Это исследование поддерживается Национальными институтами здравоохранения RO1 грантов HL95077, HL114120, HL131017, HL138023, UO1 HL134764 (до J. З.), и HL121206A1 (в Л.З.), и R56 грант 16SDG30410018, и Университет Алабамы в Бирмингеме факультета развития Грант (до В.З.).

Materials

Reagent
Accutase (stem cell detachment solution) STEMCELL Technologies #07920
B27 minus insulin Fisher Scientific A1895601
B27 Supplement Fisher Scientific 17-504-044
CHIR99021 Stem Cell Technologies 72054
DMEM (1x), high glucose, HEPES, no phenol red Thermofisher 20163029
Fetal bovine serum Atlanta Biologicals S11150
Fluo-4 AM (calcium indicator) Invitrogen/Thermofisher F14201
Glucose-free RPMI 1640 Fisher Scientific 11879020
IWR1 Stem Cell Technologies 72562
Matrigel (extracellular matrix ) Fisher Scientific CB-40230C
mTeSR (human pluripotent stem cells medium) STEMCELL Technologies 85850
Pen-strep antibiotic Fisher Scientific 15-140-122
Pluronic F-127 (surfactant polyol) Sigma-Aldrich P2443
Rho activator II Cytoskeleton CN03
RPMI1640 Fisher Scientific 11875119
Sodium DL-lactate Sigma-Aldrich L4263
TrypLE (cell-dissociation enzymes) Fisher Scientific 12-605-010
Verapamil Sigma-Aldrich V4629
Y-27632 STEMCELL Technologies 72304
Name Company Catalog Number Comments
Equipment and Supplies
IVIS Lumina III Bioluminescence Instruments PerkinElmer CLS136334
15 mm Coverslips Warner CS-15R15
Centrifuge Eppendorf 5415R
Confocal Microscope Olympus IX81
Cryostat Thermo Scientific NX50
Dual Automatic Temperature Controller Warner Instruments TC-344B
Electrophoresis Power Supply BIO-RAD 1645050
Fluoresence Microscope Olympus IX83
High Speed Camera pco 1200 s
Laser Scan Head Olympus FV-1000
Low Profile Open Bath Chamber (mounts into above microincubation system) Warner Instruments RC-42LP
Microincubation System Warner Instruments DH-40iL
Minivent Mouse Ventilator Harvard Apparatus 845
NOD/SCID mice Jackson Laboratory 001303
Precast Protein Gels BIO-RAD 4561033
PVDF Transfer Packs BIO-RAD 1704156
Trans-Blot System BIO-RAD Trans-Blot Turbo
Hot bead sterilizer Fine Science Tools 18000-45
Name Company Catalog Number Comments
Antibody
Anti-human Nucleolin (Alexa Fluor 647) Abcam ab198580
Cardiac Troponin T R&D Systems MAB1874
Cardiac Troponin C Abcam ab137130
Cardiac Troponin I Abcam ab47003
Cy5-donkey anti-mouse Jackson ImmunoResearch Laboratory 715-175-150
Cy3-donkey anti-rabbit Jackson ImmunoResearch Laboratory 711-165-152
Fitc-donkey anti-mouse Jackson ImmunoResearch Laboratory 715-095-150
GAPDH Abcam ab22555
Human Cardiac Troponin T Abcam ab91605
Integrin β1 Abcam ab24693
Ki67 EMD Millipore ab9260
N-cadherin Abcam ab18203
Phospho-Myosin Light Chain 2 Cell Signaling Technology 3671s
Name Company Catalog Number Comments
Software
Matlab MathWorks R2016A
Image J NIH 1.52g

References

  1. Menasche, P., et al. Towards a clinical use of human embryonic stem cell-derived cardiac progenitors: a translational experience. European Heart Journal. 36 (12), 743-750 (2015).
  2. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
  3. Frisch, S. M., Francis, H. Disruption of epithelial cell-matrix interactions induces apoptosis. Journal of Cell Biology. 124 (4), 619-626 (1994).
  4. Haun, F., et al. Identification of a novel anoikis signalling pathway using the fungal virulence factor gliotoxin. Nature Communications. 9 (1), 3524 (2018).
  5. Ohashi, K., et al. Rho-associated kinase ROCK activates LIM-kinase 1 by phosphorylation at threonine 508 within the activation loop. Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3577-3582 (2000).
  6. Katoh, K., Kano, Y., Noda, Y. Rho-associated kinase-dependent contraction of stress fibres and the organization of focal adhesions. Journal of The Royal Society Interface. 8 (56), 305-311 (2011).
  7. Paoli, P., Giannoni, E., Chiarugi, P. Anoikis molecular pathways and its role in cancer progression. Biochimica et Biophysica Acta. 1833 (12), 3481-3498 (2013).
  8. Legate, K. R., Fassler, R. Mechanisms that regulate adaptor binding to beta-integrin cytoplasmic tails. Journal of Cell Science. 122 (Pt 2), 187-198 (2009).
  9. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
  10. Emre, N., et al. The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers. PLoS One. 5 (8), e12148 (2010).
  11. Ni, Y., Qin, Y., Fang, Z., Zhang, Z. ROCK Inhibitor Y-27632 Promotes Human Retinal Pigment Epithelium Survival by Altering Cellular Biomechanical Properties. Current Molecular Medicine. 17 (9), 637-646 (2017).
  12. Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature Biotechnology. 25 (9), 1015-1024 (2007).
  13. Zhu, W., Zhao, M., Mattapally, S., Chen, S., Zhang, J. CCND2 Overexpression Enhances the Regenerative Potency of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes: Remuscularization of Injured Ventricle. Circulation Research. 122 (1), 88-96 (2018).
  14. Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
  15. Ye, L., et al. Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells. Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).
  16. Tohyama, S., et al. Glutamine Oxidation Is Indispensable for Survival of Human Pluripotent Stem Cells. Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).
  17. Ong, S. G., et al. Microfluidic Single-Cell Analysis of Transplanted Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes After Acute Myocardial Infarction. Circulation. 132 (8), 762-771 (2015).
  18. Zhao, M., et al. Y-27632 Preconditioning Enhances Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes in Myocardial Infarction Mice. Cardiovascular Research. , (2018).
  19. Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
  20. Silginer, M., Weller, M., Ziegler, U., Roth, P. Integrin inhibition promotes atypical anoikis in glioma cells. Cell Death & Disease. 5, e1012 (2014).
  21. Lelievre, E. C., et al. N-cadherin mediates neuronal cell survival through Bim down-regulation. PLoS One. 7 (3), e33206 (2012).
  22. Murata, K., et al. Increase in cell motility by carbon ion irradiation via the Rho signaling pathway and its inhibition by the ROCK inhibitor Y-27632 in lung adenocarcinoma A549 cells. Journal of Radiation Research. 55 (4), 658-664 (2014).
  23. Srivastava, K., Shao, B., Bayraktutan, U. PKC-beta exacerbates in vitro brain barrier damage in hyperglycemic settings via regulation of RhoA/Rho-kinase/MLC2 pathway. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (12), 1928-1936 (2013).

Play Video

Cite This Article
Zhao, M., Tang, Y., Ernst, P. J., Kahn-Krell, A., Fan, C., Pretorius, D., Zhu, H., Lou, X., Zhou, L., Zhang, J., Zhu, W. Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity. J. Vis. Exp. (149), e59452, doi:10.3791/59452 (2019).

View Video