Summary

Mejorar el injerto de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por el hombre a través de una inhibición transitoria de la actividad de Rho Kinase

Published: July 10, 2019
doi:

Summary

En este protocolo, demostramos y profundizamos en cómo utilizar células madre pluripotentes inducidas por el hombre para la diferenciación y purificación de cardiomiocitos, y más adelante, sobre cómo mejorar su eficiencia de trasplante con inhibidor de la proteína quinasa asociada a Rho pretratamiento en un modelo de infarto de miocardio de ratón.

Abstract

Un factor crucial en la mejora de la eficacia de la terapia celular para la regeneración miocárdica es aumentar de forma segura y eficiente la tasa de injerto celular. Y-27632 es un inhibidor muy potente de Rho-asociado, bobina enrollada-que contiene proteína quinasa (RhoA/ROCK) y se utiliza para prevenir la disociación inducida por la apoptosis celular (anoikis). Demostramos que el pretratamiento Y-27632 para cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por el hombre (hiPSC-MC+RI)antes de la implantación da como resultado una mejora de la tasa de injerto celular en un modelo de ratón de infarto agudo de miocardio (MI). Aquí, describimos un procedimiento completo de diferenciación hiPSC-CM, purificación y pretratamiento celular con Y-27632, así como la contracción celular resultante, mediciones transitorias de calcio y trasplante en modelos MI de ratón. El método propuesto proporciona un método simple, seguro, eficaz y de bajo costo que aumenta significativamente la tasa de injerto celular. Este método no sólo puede utilizarse junto con otros métodos para mejorar aún más la eficiencia del trasplante de células, sino que también proporciona una base favorable para el estudio de los mecanismos de otras enfermedades cardíacas.

Introduction

Las terapias basadas en células madre han demostrado un potencial considerable como tratamiento para el daño cardíaco causado por MI1. El uso de hiPSC diferenciados proporciona una fuente inagotable de hiPSC-CP2 y abre la puerta al rápido desarrollo de tratamientos innovadores. Sin embargo, siguen existiendo muchas limitaciones a la traducción terapéutica, incluido el desafío de la tasa de injerto severamente baja de las células implantadas.

La disociación de células con trippsina inicia anoikis3, que sólo se acelera una vez que estas células se inyectan en ambientes hostiles como el miocardio isquémico, donde el ambiente hipóxico acelera el curso hacia la muerte celular. De las células restantes, una gran proporción se lava desde el sitio de implantación en el torrente sanguíneo y se extiende por toda la periferia. Una de las vías apoptoticas clave es la vía RhoA/ROCK4. Basado en investigaciones previas, la vía RhoA/ROCK regula la organización citoesquelética actina5,6, que es responsable de la disfunción celular7,8. El inhibidor DE ROCK Y-27632 es ampliamente utilizado durante la disociación somática y de célulasmadre y el passaging, para aumentar la adhesión celular y reducir la apoptosis celular 9,10,11. En este estudio, Y-27632 se utiliza para tratar hiPSC-CM antes del trasplante en un intento de aumentar la tasa de injerto celular.

Se han establecido varios métodos destinados a mejorar la tasa de injerto celular, como el choque térmico y el recubrimiento de matriz de membrana de sótano12. Aparte de estos métodos, la tecnología genética también puede promover la proliferación de cardiomiocitos13 o revertir las células no miocárdicas en cardiomiocitos14. Desde la perspectiva de la bioingeniería, los cardiomiocitos se asintan en un andamio biomaterial para mejorar la eficiencia del trasplante15. Desafortunadamente, la mayoría de estos métodos son complicados y costosos. Por el contrario, el método propuesto aquí es simple, rentable y eficaz, y se puede utilizar como tratamiento basal antes del trasplante, así como en conjugación con otras tecnologías.

Protocol

Todos los procedimientos animales en este estudio fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Alabama en Birmingham y se basaron en los Institutos Nacionales de Guías de Cuidado y Uso de Animales del Laboratorio de Salud (NIH Publication No 85-23). 1. Preparación de medios de cultivo y placas de cultura Preparación media Para el medio hiPSC, mezclar 400 mL de célula madre pluripotente humana (…

Representative Results

Los hiPSC-CM utilizados en este estudio se derivaron de origen humano con el gen reportero de luciferasa; por lo tanto, la tasa de supervivencia de las células trasplantadas in vivo se detectó mediante imágenes de bioluminiscencia (BLI)17 (Figura 1A,B). Para las secciones histológicas del corazón, las células dobles positivas de la troponina cardíaca T (hcTnT) y del antígeno nuclear humano (HNA) se clasificaron…

Discussion

Los pasos clave de este estudio incluyen la obtención de hiPSC-CM puros, la mejora de la actividad de los hiPSC-CM a través del pretratamiento Y-27632 y, por último, el trasplante de una cantidad precisa de hiPSC-CM en un modelo de MI de ratón.

Las cuestiones clave que se abordaron aquí fueron que, en primer lugar, optimizamos los métodos de purificación sin glucosa19 y establecimos un novedoso sistema de purificación eficiente. El procedimiento del sistema incl…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores agradecen al Dr. Joseph C. Wu (Universidad de Stanford) por proporcionar amablemente la construcción Fluc-GFP y al Dr. Yanwen Liu por su excelente asistencia técnica. Este estudio cuenta con el apoyo de las becas HL95077, HL114120, HL131017, HL138023, UO1 HL134764 (a J.Z.), y HL121206A1 (a L.Z.), y una beca R56 HL142627 (a W.Z.), una Asociación Americana de Desarrollo del Corazón, una Beca de Desarrollo del Corazón 16SDG30410018, y la Universidad de Alabama en Birmingham Faculty Development Grant (a W.Z.).

Materials

Reagent
Accutase (stem cell detachment solution) STEMCELL Technologies #07920
B27 minus insulin Fisher Scientific A1895601
B27 Supplement Fisher Scientific 17-504-044
CHIR99021 Stem Cell Technologies 72054
DMEM (1x), high glucose, HEPES, no phenol red Thermofisher 20163029
Fetal bovine serum Atlanta Biologicals S11150
Fluo-4 AM (calcium indicator) Invitrogen/Thermofisher F14201
Glucose-free RPMI 1640 Fisher Scientific 11879020
IWR1 Stem Cell Technologies 72562
Matrigel (extracellular matrix ) Fisher Scientific CB-40230C
mTeSR (human pluripotent stem cells medium) STEMCELL Technologies 85850
Pen-strep antibiotic Fisher Scientific 15-140-122
Pluronic F-127 (surfactant polyol) Sigma-Aldrich P2443
Rho activator II Cytoskeleton CN03
RPMI1640 Fisher Scientific 11875119
Sodium DL-lactate Sigma-Aldrich L4263
TrypLE (cell-dissociation enzymes) Fisher Scientific 12-605-010
Verapamil Sigma-Aldrich V4629
Y-27632 STEMCELL Technologies 72304
Name Company Catalog Number Comments
Equipment and Supplies
IVIS Lumina III Bioluminescence Instruments PerkinElmer CLS136334
15 mm Coverslips Warner CS-15R15
Centrifuge Eppendorf 5415R
Confocal Microscope Olympus IX81
Cryostat Thermo Scientific NX50
Dual Automatic Temperature Controller Warner Instruments TC-344B
Electrophoresis Power Supply BIO-RAD 1645050
Fluoresence Microscope Olympus IX83
High Speed Camera pco 1200 s
Laser Scan Head Olympus FV-1000
Low Profile Open Bath Chamber (mounts into above microincubation system) Warner Instruments RC-42LP
Microincubation System Warner Instruments DH-40iL
Minivent Mouse Ventilator Harvard Apparatus 845
NOD/SCID mice Jackson Laboratory 001303
Precast Protein Gels BIO-RAD 4561033
PVDF Transfer Packs BIO-RAD 1704156
Trans-Blot System BIO-RAD Trans-Blot Turbo
Hot bead sterilizer Fine Science Tools 18000-45
Name Company Catalog Number Comments
Antibody
Anti-human Nucleolin (Alexa Fluor 647) Abcam ab198580
Cardiac Troponin T R&D Systems MAB1874
Cardiac Troponin C Abcam ab137130
Cardiac Troponin I Abcam ab47003
Cy5-donkey anti-mouse Jackson ImmunoResearch Laboratory 715-175-150
Cy3-donkey anti-rabbit Jackson ImmunoResearch Laboratory 711-165-152
Fitc-donkey anti-mouse Jackson ImmunoResearch Laboratory 715-095-150
GAPDH Abcam ab22555
Human Cardiac Troponin T Abcam ab91605
Integrin β1 Abcam ab24693
Ki67 EMD Millipore ab9260
N-cadherin Abcam ab18203
Phospho-Myosin Light Chain 2 Cell Signaling Technology 3671s
Name Company Catalog Number Comments
Software
Matlab MathWorks R2016A
Image J NIH 1.52g

References

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Zhao, M., Tang, Y., Ernst, P. J., Kahn-Krell, A., Fan, C., Pretorius, D., Zhu, H., Lou, X., Zhou, L., Zhang, J., Zhu, W. Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity. J. Vis. Exp. (149), e59452, doi:10.3791/59452 (2019).

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