Melhorar o Engraftment de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por uma inibição transitória da atividade da Rho kinase
Summary
Neste protocolo, podemos demonstrar e elaborar sobre como usar células-tronco pluripotentes induzidas por humanos para diferenciação e purificação de cardiomiócitos, e ainda, sobre como melhorar sua eficiência de transplante com inibidor de proteína quinase associada a Rho pré-tratamento em um modelo de infarto do miocárdio do camundongo.
Abstract
Um fator crucial na melhoria da eficácia da terapia celular para a regeneração miocárdica é de forma segura e eficiente aumentar a taxa de Engraftment celular. Y-27632 é um inibidor altamente potente da proteína quinase (RhoA/ROCK) associada a Rho, coiled-coil, e é usada para prevenir a apoptose celular induzida por dissociação (anoikis). Nós demonstramos que o pré-tratamento de Y-27632 para os cardiomiócitos pluripotentes induzidos humanos da pilha de haste (hiPSC-CMs+ ri) antes da implantação conduz a uma melhoria da taxa do Engraftment da pilha em um modelo do rato do infarction miocárdico agudo (MI). Aqui, nós descrevemos um procedimento completo da diferenciação, da purificação, e do pré-tratamento da pilha do hiPSC-CMs com Y-27632, assim como a contração resultante da pilha, as medidas transientes do cálcio, e a transplantação em modelos do rato MI. O método proposto fornece um método simples, seguro, eficaz e de baixo custo que aumenta significativamente a taxa de Engraftment celular. Este método não pode somente ser usado conjuntamente com outros métodos para realçar mais a eficiência da transplantação da pilha mas igualmente fornece uma base favorável para o estudo dos mecanismos de outras doenças cardíacas.
Introduction
As terapias baseadas em células-tronco mostraram um potencial considerável como um tratamento para danos cardíacos causados pelo MI1. O uso de hiPSCs diferenciados fornece uma fonte inesgotável de hiPSC-CMs2 e abre a porta para o rápido desenvolvimento de tratamentos inovadores. Entretanto, muitas limitações à tradução terapêutica permanecem, incluindo o desafio da taxa severamente baixa do Engraftment de pilhas implantadas.
Dissociar células com tripsina inicia anoikis3, que só é acelerado uma vez que estas células são injetadas em ambientes agressivos como o miocárdio isquêmico, onde o ambiente hipóxico acelera o curso em direção à morte celular. Das células remanescentes, uma grande proporção é lavada do local de implantação para a corrente sanguínea e se espalhou por toda a periferia. Uma das principais vias apoptóticas é a via RhoA/ROCK4. Com base em pesquisas anteriores, a via Rhoa/rock regula a organização citoesquelética actina5,6, que é responsável pela disfunção celular7,8. O inibidor da rocha Y-27632 é amplamente utilizado durante a dissociação e passaging de células estéticas e somáticas, para aumentar a adesão celular e reduzir a apoptose celular9,10,11. Neste estudo, o Y-27632 é usado para tratar o hiPSC-CMs antes da transplantação na tentativa de aumentar a taxa do Engraftment da pilha.
Vários métodos destinados a melhorar a taxa de Engraftment celular, tais como choque térmico e revestimento da matriz de membrana basal12, foram estabelecidas. Além desses métodos, a tecnologia genética também pode promover a proliferação de cardiomiócitos13 ou células não miocárdicas reversas em cardiomiócitos14. Do ponto de vista da bioengenharia, os cardiomiócitos são semeados em um andaime biomaterial para melhorar a eficiência do transplante15. Infelizmente, a maioria destes métodos são complicados e dispendiosos. Pelo contrário, o método proposto aqui é simples, econômico e efetivo, podendo ser utilizado como tratamento basal antes do transplante, bem como na conjugação com outras tecnologias.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os principais passos deste estudo incluem a obtenção de Hisc-CMs puro, melhorando a atividade do hiPSC-CMs através do pré-tratamento Y-27632 e, finalmente, transplantar uma quantidade exata de hiPSC-CMs em um modelo de MI do mouse.
As principais questões abordadas aqui foram que, primeiro, otimizamos os métodos de purificação sem glicose19 e estabelecemos um novo sistema de purificação eficiente. O procedimento de sistema incluiu a aplicação de enzimas de di…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem ao Dr. Joseph C. Wu (Universidade de Stanford) por gentilmente fornecer o constructo Fluc-GFP e o Dr. Yanwen Liu para uma excelente assistência técnica. Este estudo é apoiado pelos institutos nacionais de saúde RO1 concede HL95077, HL114120, HL131017, HL138023, UO1 HL134764 (a J.Z.), e HL121206A1 (a L.Z.), e um R56 conceder HL142627 (a W.Z.), uma associação americana de desenvolvimento do cientista do coração Grant 16SDG30410018, e a Universidade de Alabama na concessão do desenvolvimento da faculdade de Birmingham (a W.Z.).
Materials
| Reagent | |||
| Accutase (stem cell detachment solution) | STEMCELL Technologies | #07920 | |
| B27 minus insulin | Fisher Scientific | A1895601 | |
| B27 Supplement | Fisher Scientific | 17-504-044 | |
| CHIR99021 | Stem Cell Technologies | 72054 | |
| DMEM (1x), high glucose, HEPES, no phenol red | Thermofisher | 20163029 | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Fluo-4 AM (calcium indicator) | Invitrogen/Thermofisher | F14201 | |
| Glucose-free RPMI 1640 | Fisher Scientific | 11879020 | |
| IWR1 | Stem Cell Technologies | 72562 | |
| Matrigel (extracellular matrix ) | Fisher Scientific | CB-40230C | |
| mTeSR (human pluripotent stem cells medium) | STEMCELL Technologies | 85850 | |
| Pen-strep antibiotic | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| Pluronic F-127 (surfactant polyol) | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Rho activator II | Cytoskeleton | CN03 | |
| RPMI1640 | Fisher Scientific | 11875119 | |
| Sodium DL-lactate | Sigma-Aldrich | L4263 | |
| TrypLE (cell-dissociation enzymes) | Fisher Scientific | 12-605-010 | |
| Verapamil | Sigma-Aldrich | V4629 | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment and Supplies | |||
| IVIS Lumina III Bioluminescence Instruments | PerkinElmer | CLS136334 | |
| 15 mm Coverslips | Warner | CS-15R15 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Confocal Microscope | Olympus | IX81 | |
| Cryostat | Thermo Scientific | NX50 | |
| Dual Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B | |
| Electrophoresis Power Supply | BIO-RAD | 1645050 | |
| Fluoresence Microscope | Olympus | IX83 | |
| High Speed Camera | pco | 1200 s | |
| Laser Scan Head | Olympus | FV-1000 | |
| Low Profile Open Bath Chamber (mounts into above microincubation system) | Warner Instruments | RC-42LP | |
| Microincubation System | Warner Instruments | DH-40iL | |
| Minivent Mouse Ventilator | Harvard Apparatus | 845 | |
| NOD/SCID mice | Jackson Laboratory | 001303 | |
| Precast Protein Gels | BIO-RAD | 4561033 | |
| PVDF Transfer Packs | BIO-RAD | 1704156 | |
| Trans-Blot System | BIO-RAD | Trans-Blot Turbo | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Anti-human Nucleolin (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab198580 | |
| Cardiac Troponin T | R&D Systems | MAB1874 | |
| Cardiac Troponin C | Abcam | ab137130 | |
| Cardiac Troponin I | Abcam | ab47003 | |
| Cy5-donkey anti-mouse | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 715-175-150 | |
| Cy3-donkey anti-rabbit | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 711-165-152 | |
| Fitc-donkey anti-mouse | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 715-095-150 | |
| GAPDH | Abcam | ab22555 | |
| Human Cardiac Troponin T | Abcam | ab91605 | |
| Integrin β1 | Abcam | ab24693 | |
| Ki67 | EMD Millipore | ab9260 | |
| N-cadherin | Abcam | ab18203 | |
| Phospho-Myosin Light Chain 2 | Cell Signaling Technology | 3671s | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Matlab | MathWorks | R2016A | |
| Image J | NIH | 1.52g |
References
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