用于分离共转录RNA处理事件的人工RNA聚合酶II伸长复合物
Summary
在这里,我们描述了RNA聚合酶II(Pol II)伸长复合物的组装,只需要短的合成DNA和RNA寡核苷酸和纯化Pol II。这些复合物可用于研究与 Pol II 伸长复合体相关的转录记录的基本机制。
Abstract
欧核酸mRNA合成是一个复杂的生化过程,需要通过多亚单位酶RNA聚合酶II将DNA模板转录到前体RNA中,并共同转录前体RNA的封顶和拼接,以形成成熟的mRNA。在mRNA合成过程中,RNA聚合酶II伸长复合物是控制其催化活性的大量转录因子以及产生成熟mRNA的封顶、拼接和3’处理酶的调控目标。由于mRNA合成固有的复杂性,更简单的实验系统能够分离和研究其不同的共转录阶段具有很大的效用。
在本文中,我们描述了一个这样一个简单的实验系统,适用于研究共转录RNA上限。该系统依赖于从纯化聚合酶和人工转录气泡中组装的已定义的RNA聚合酶II伸长复合物。当通过生物浸化DNA固定时,这些RNA聚合酶II伸长复合物提供了一个易于操作的工具,用于解剖共转录RNA封顶和机制,通过该机制,伸长复合物在共转录RNA封顶。我们预计该系统可以适应研究蛋白质或蛋白质复合物的招募和/或组装,在mRNA成熟与RNA聚合酶II伸长复合物耦合的其他阶段中发挥作用。
Introduction
Eukaryotic信使RNA(mRNA)合成是一个精细的生化过程,涉及通过RNA聚合酶II合成未加工的前体RNA和加工前体RNA以产生成熟的mRNA。RNA的封盖、拼接和聚化处理步骤主要以共同转录的形式进行。Pol II 伸长复合体作为脚手架,用于招募和协调许多RNA处理酶的活动。因此,我们对成熟真核子病mRNA生成方式的最终理解将严重依赖实验系统的开发,以便对伸长复合体和调节负责共转录封顶、拼接和多吸收的酶。
毫不奇怪,这种实验系统的开发是困难的。一个主要障碍是Pol II转录本身的显著复杂性,只需通过Pol II体外重建基础转录,至少需要一组五个一般转录启动因子:TFIIB、TFIID、TFIIE、TFIIF和TFIIH1.此外,在体外重组任何类型的受监管的Pol II转录需要一套更大的转录因子和共子调节器。因此,一个主要目标是开发更简单的实验系统,以便重组适合研究Pol II转录和RNA处理功能耦合的活性Pol II伸长复合物。
一种用于重组活性Pol II伸长复合物的更简单方法已被证明对拉长Pol II的结构和生化研究,以及最近用于研究共转录RNA处理2,3) 都很有用 ,4,5.在本文中,我们将展示如何有效地利用从纯化的 Pol II 和合成转录气泡制备的 Pol II 伸长复合物来研究新生 Pol II 转录的共转录封顶机制。
封顶是指在新生的Pol II成绩单的5′-三磷酸盐端共价添加5′-角苷”帽”。该上限对于mRNA成熟、传输、翻译和其他过程的后续步骤非常重要6,7。该帽由一种称为封盖酶的酶共同添加到Pol II转录本中。在哺乳动物细胞中,负责冠形酶RNA5′-三磷酸酶和甘宁醇转移酶活性的活性位点包含在单个多肽8中。封顶酶通过与Pol II体上尚未定义的表面相互作用,被招募到Pol II伸长复合体,而Rpb1卡博西终端域(CTD)在其heptapeptideSer5上所覆盖的磷酸化。在伸长复合物中,一旦新生的转录达到至少18个核苷酸的长度,并且从聚合酶RNA退出通道中出现,封顶酶催化添加5′-角苷帽。在封顶反应的第一步,三磷酸酶水解RNA 5′-三磷酸盐,产生5′-双磷酸盐。在第二步中,GTP通过甘胶转移酶水解至GMP,形成GMP封盖酶中间体。最后,甘柳转酶将GMP转移到新生转录本的5′-二磷酸盐端,以产生盖子。
封顶反应的一个显著特征是,共转录封顶(即,与功能Pol II伸长复合物相关的转录的封顶)比自由RNA5,9的封顶更有效。因此,该领域的一个主要问题是,如何通过封盖酶与Pol II伸长复合物的相互作用来实现封盖的这种戏剧性的激活。在此协议中,我们描述了仅使用纯化RNA聚合酶II和人工转录气泡的活性RNA聚合酶II伸长复合物的组装。这些方法允许创建RNA聚合酶II伸长复合物与定义的长度和序列的转录。在最近的一项研究中,我们使用这些定义的RNA聚合酶II伸长复合物作为研究RNA封盖5机制方面的模型。特别是,我们表明:(i)与这些伸长复合物相关的RNA的封顶比自由RNA的封顶效率高100倍以上,(ii)由POL II CTD的TFIIH依赖磷酸化刺激。这里描述的方法原则上可以适应生成基质,用于研究与Pol II伸长复合物相关的其他共转录RNA处理反应。
在该协议的第 1 节中,人工伸长复合物是通过将合成模板链 DNA 寡核苷酸退火到 RNA 寡核苷酸,在其 3’端与模板链 DNA 的大约 9 个核苷酸互补而创建的。然后,Pol II 被加载到 DNA:RNA 复工中。然后,通过添加部分互补、非模板链DNA寡核苷酸,在其3’端贴上生物锡标记(图1和图2A),完成伸长复合物。这些伸长复合物中的POL II扩展RNA寡核苷酸,在添加放射性标记核苷酸的适当组合后,使放射性标记转录转录记录具有定义的长度和序列。此外,使用混合使用轮回去除未结合的核苷酸和进一步添加不同的核苷酸组合,可以”行走”Pol II沿DNA模板的不同位置,并合成确定长度的RNA。然后,RNA在变性尿素-PAGE凝胶中进行纯化并进行电泳。在协议的第2节中,人工伸长复合物用于分析共转录RNA封顶。该示例介绍了 POL II CTD 的 TFIIH 依赖磷酸化对共转录RNA封顶的影响。在本实验中,我们测量共转录封顶的程度,作为封盖酶浓度(每次反应5、15和45纳克)和时间(1、2和4分钟)的函数。
Protocol
Representative Results
Discussion
通过使用高度纯化的酶系统,可以大大促进研究,以解剖与Pol II伸长复合物耦合的事件,如RNA处理和转录伸长本身的调节。建立这种酶系统可能具有挑战性。Pol II 的启动子依赖转录至少需要五个一般转录因子。准备和储存这些因素可能需要数月时间;因此,在这个过程中的速率限制步骤往往只是准备在试管中重组基础转录所需的转录因子。
在本文中,我们描述了对以前开发的方法的?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢S.Shuman提供哺乳动物封顶酶cDNA。这项工作部分得到了大堪萨斯城社区基金会海伦·纳尔逊医学研究基金的资助。 本手稿的原始数据可以从 http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1434 的 Stowers 原始数据存储库访问。
Materials
| [α-32P] UTP (3000 Ci/mmol), 1 mCi | Perkin Elmer | NEG007H001MC | For radiolabeling RNA |
| 2x RNA loading dye | New England Biolabs | B0363S | Highly recommended. For preparing RNA during gel loading |
| 40% Bis:Acrylamide solution | Biorad | 1610144 | |
| Bovine Serum Albumin (20 mg/ml) | New England Biolabs | B9000S | |
| Cdk7/Cyclin H/MAT1 (CAK complex) Protein, active, 10 µg | Millipore Sigma | 14-476 | Used to phosphorylate Pol II CTD |
| DNA oligonucleotides | IDT | See Table 8 for purity specifications | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Life Technologies Invitrogen | 65001 | We have also used Dynabeads M-280 streptavidin without problem but prefer MyOne Streptavidin beads because they sediment more slowly |
| GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/ml) | Life Technologies Invitrogen | AM9516 | Highly recommended. Dyes nucleic-acid pellet blue making reactions much easier to handle |
| Hoefer SE600 standard dual cooled vertical electrophoresis system with 1 mm spacers and 15 well comb | Hoefer | SE600-15-1.5 | |
| MaXtract high density tubes (1.5 ml) | Qiagen | 129046 | Highly recommended. Contains a high density gel that forms a stable barrier between aqueous and organic phases; improves RNA yields during extractions |
| Proteinase K solution (20 mg/ml) | Life Technologies Invitrogen | 25530049 | |
| RNA oligonucleotides | Trilink | See Table 8 for more details | |
| Yeast Inorganic Pyrophosphatase (100 units/ml) | New England Biolabs | NEBM2403S | Required only during capping reactions |
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