인공 RNA 폴리머라제 II 연신복합체 해부 공동 전사 RNA 처리 이벤트
Summary
여기서, 우리는 짧은 합성 DNA 및 RNA 올리고뉴클레오티드 및 정제된 Pol II를 필요로 하는 RNA 폴리머라제 II(Pol II) 신장 복합체의 조립을 기술한다. 이들 복합체는 Pol II 신장 복합체와 관련된 전사체의 기본 공동 전사 처리를 연구하는 데 유용하다.
Abstract
진핵 mRNA 합성은 성숙한 mRNA를 형성하기 위하여 전구체 RNA의 다중 소단위 효소 RNA 폴리머라제 II 및 공동 전사 상한 및 접합에 의해 전구체 RNA내로 DNA 템플릿의 전사를 요구하는 복잡한 생화확적인 프로세스이다. mRNA 합성 동안, RNA 폴리머라제 II 신장 복합체는 성숙한 mRNA를 생성하는 캡핑, 접합 및 3′-처리 효소뿐만 아니라 촉매 활성을 조절하는 전사 인자의 큰 집합에 의해 조절을 위한 표적이 된다. mRNA 합성의 본질적인 복잡성 때문에, 그것의 각종 공동 전사 단계의 격리 그리고 조사를 가능하게 하는 간단한 실험 시스템은 중대한 유용성이 있습니다.
이 문서에서는, 우리는 공동 전사 RNA 상한을 조사하기에 적합한 1개의 간단한 실험 시스템을 기술합니다. 이 시스템은 정제 된 폴리머 라제 및 인공 전사 기포에서 조립 된 정의 된 RNA 폴리머 라제 II 신장 복합체에 의존합니다. 생체 생리DNA를 통해 고정화될 때, 이 RNA 폴리머라제 II 신장 복합체는 연신복합체가 캡핑 효소를 모집하고 조절하는 공동 전사 RNA 캡핑 및 메커니즘을 해부하기 위한 용이한 방법론을 제공합니다. 공동 전사 RNA 캡핑. 우리는 이 시스템이 RNA 중합효소 II 신장 복합체에 결합된 mRNA 성숙의 그밖 단계에서 역할을 가진 단백질 또는 단백질 복합체의 모집 및/또는 집합을 공부하기 위해 적응될 수 있었다는 것을 예상합니다.
Introduction
진핵 메신저 RNA (mRNA) 합성은 RNA 폴리머라제 II에 의해 처리되지 않은 전구체 RNA의 합성및 성숙한 mRNA를 산출하기 위하여 전구체 RNA의 처리를 관련시키는 정교한 생화확적인 프로세스입니다. 캡핑, 접합 및 폴리아데닐화의 RNA 처리 단계는 대체로 공동 전사적으로 수행된다. Pol II 신장 복합체는 많은 RNA 처리 효소의 활동을 모집하고 조율하는 발판역할을 합니다. 따라서, 성숙한 진핵 mRNAs가 생성되는 방법의 우리의 궁극적인 이해는 신장 복합체에 근본적인 모집을 근본적인 생화학 기계장치의 해부를 허용하는 실험 적인 시스템의 발달에 크게 의지할 것입니다 공동 전사 캡핑, 접합 및 폴리아데닐화를 담당하는 효소의 조절.
당연히, 이러한 실험 시스템의 개발은 어려웠다. 주요 장애는 단순히 시험관내에서 Pol II에 의한 기저 전사를 재구성하는 것이 5가지 일반 전사 개시 인자(TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF, 및 TFIIH)의 최소 세트를 필요로 하는 Pol II 전사 자체의 현저한 복잡성이었습니다. 1. 또한, 시험관 내에서 규제 된 Pol II 전사의 모든 종류를 재구성하려면 전사 인자 및 공동 조절기의 더 큰 세트가 필요합니다. 따라서, 주요 목표는 Pol II 전사 및 RNA 처리의 기능적 커플링의 조사에 적합한 활성 Pol II 신장 복합체의 재구성을 허용하는 간단한 실험 시스템을 개발하는 것이었습니다.
활성 Pol II 신장 복합체를 재구성하는 이러한 간단한 방법 중 하나는 연공 폴 II의 구조적 및 생화학적 연구에 유용하며, 최근에는공동 전사 RNA 처리 2, 3을 조사하는 데 유용하게 사용되었습니다. ,4,5. 이 문서에서는, 우리는 정제된 Pol II 및 합성 전사 기포로부터 제조된 Pol II 신장 복합체가 어떻게 초기 Pol II 전사의 공동 전사 캡핑의 근본적인 메커니즘을 조사하기 위해 효과적으로 사용될 수 있는지를 보여준다.
캡핑은 초기 Pol II 전사체의 5′-트리포스페이트 말단에 5′-구아노신 “캡”을 공동 첨가하는 것을 말합니다. 캡은 mRNA 성숙, 전송, 번역 및 기타 프로세스6,7의후속 단계에 중요합니다. 캡은 캡핑 효소로 지칭되는 효소에 의해 Pol II 전사체에 공동 전사적으로 첨가된다. 포유류 세포에서, 캡핑 효소의 RNA 5′-트리포스파타제 및 구아릴 전이 효소 활성을 담당하는 활성 부위는 단일 폴리펩티드8내에 함유되어 있다. 캡핑 효소는 그 힙테이프타이드 반복의 Ser5상에 포진된 Pol II 체체 및 Rpb1 카르복시 말단 도메인(CTD)에 아직 정의된 표면과의 상호작용을통해 Pol II 신장 복합체로 모집된다 5. 신장 복합체에서, 캡핑 효소는 초기 전사체가 적어도 18개의 뉴클레오티드의 길이에 도달하고 중합효소 RNA 출구 채널로부터 나오면 5′-구아노신 캡의 첨가를 촉매한다. 캡핑 반응의 첫 번째 단계에서, 트리포스파아제는 RNA 5′-트리포스페이트5′-이인산염을 산출하기 위해 가수분해한다. 제 2 단계에서, GTP는 GMP 캡핑 효소 중간체를 형성하는 guanylyl 트랜스페라제에 의해 GMP로 가수분해된다. 마지막으로, guanylyl 트랜스퍼라제는 캡을 생성하기 위해 초기 전사체의 5′-디포스페이트 말단으로 GMP를 전송한다.
캡핑 반응의 주목할 만한 특징은 공동 전사 캡핑(즉, 기능성 Pol II 신장 복합체와 관련된 전사체의 캡핑)이 자유RNA 5,9의캡핑보다 훨씬 더 효율적이라는 것이다. 따라서, 현장에서 중요한 질문은 폴 II 신장 복합체와의 캡핑 효소의 상호 작용을 통해 캡핑의 극적인 활성화가 어떻게 이루어지는가하는 것입니다. 이 프로토콜에서 우리는 정제된 RNA 폴리머라제 II 및 인공 전사 기포만을 사용하여 활성 RNA 폴리머라제 II 신장 복합체의 조립을 기술한다. 이러한 방법은 정의된 길이 및 서열의 전사체를 가진 RNA 중합효소 II 신장 복합체의 생성을 허용한다. 최근 연구에서, 우리는 RNA 캡핑 5의 기계장치의 양상을 조사하기 위한 모형으로 이 정의된 RNA중합효소 II 신장 복합체를 이용했습니다. 특히, 우리는 (i) 이들 신장 복합체와 관련된 RNA의 캡핑이 자유 RNA의 캡핑보다 100배 이상 효율적이었으며(ii) Pol II CTD의 TFIIH 의존성 인산화에 의해 자극되었다는 것을 보여주었다. 여기서 설명된 접근법은 원칙적으로 Pol II 신장 복합체에 연결된 다른 공동 전사 RNA 처리 반응을 연구하기 위한 기판을 생성하도록 적응될 수 있었다.
이 프로토콜의 섹션 1에서, 인공 신장 복합체는 템플릿 가닥 DNA의 약 9 개의 뉴클레오티드에 3’끝에서 상보적인 RNA 올리고뉴클레오티드에 합성 템플릿 가닥 DNA 올리고뉴클레오티드를 어닐링하여 생성됩니다. Pol II는 DNA:RNA 이중에 적재됩니다. 신장 복합체는 그 후 3′-끝에서 비오틴으로 표지되는 부분적으로 상보적이고 비템플릿가닥 DNA 올리고뉴클레오티드를 첨가하여 완성된다(도1 및 도 2A). RNA 올리고뉴클레오티드는 이러한 신장 복합체에서 Pol II에 의해 확장되어 방사성 표지된 뉴클레오티드의 적절한 조합을 추가하면 정의된 길이 및 서열의 방사성 표지된 전사체를 만듭니다. 또한, 무통합 뉴클레오티드를 제거하고 뉴클레오티드의 상이한 조합을 추가로 첨가하기 위해 세차의 조합을 사용하여, 하나는 DNA 템플릿을 따라 상이한 위치에 Pol II를 “걸을”수 있고 정의된 길이의 RNA를 합성할 수 있다. RNA는 그 때 정제되고 요소-PAGE 젤을 이변하는 전기 영동을 행한다. 프로토콜의 섹션 2에서, 인공 신장 복합체는 공동 전사 RNA 캡핑을 분석하는 데 사용됩니다. 제시된 실시예는 공동 전사 RNA 캡핑에 대한 Pol II CTD의 TFIIH 의존성 인산화의 효과를 측정한다. 본 실험에서, 우리는 효소 농도(반응당 5, 15 및 45 ng)와 시간(1, 2 및 4분)의 함수로서 공동 전사 캡핑의 정도를 측정하였다.
Protocol
Representative Results
Discussion
RNA 처리 및 전사체 신장 자체의 조절과 같은 Pol II 신장 복합체에 결합된 사건을 해부하고자 하는 연구는 고도로 정제된 효소 시스템을 사용하여 크게 촉진될 수 있다. 이러한 효소 시스템을 설정하는 것은 어려울 수 있습니다. Pol II에 의한 프로모터 의존성 전사는 적어도 5개의 일반적인 전사 인자를 요구한다. 이러한 요인을 준비하고 비축하는 데는 몇 달이 걸릴 수 있습니다. 따라서, 이 과정에?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
포유류 캡핑 효소 cDNA를 제공해 주신 S. Shuman에게 감사드립니다. 이 작품은 그레이터 캔자스 시티 지역 사회 재단에서 헬렌 넬슨 의학 연구 기금에서 의학 연구를위한 Stowers 연구소에 보조금에 의해 부분적으로 지원되었다. 이 원고의 기본 원본 데이터는 http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1434 Stowers 원본 데이터 저장소에서 액세스할 수 있습니다.
Materials
| [α-32P] UTP (3000 Ci/mmol), 1 mCi | Perkin Elmer | NEG007H001MC | For radiolabeling RNA |
| 2x RNA loading dye | New England Biolabs | B0363S | Highly recommended. For preparing RNA during gel loading |
| 40% Bis:Acrylamide solution | Biorad | 1610144 | |
| Bovine Serum Albumin (20 mg/ml) | New England Biolabs | B9000S | |
| Cdk7/Cyclin H/MAT1 (CAK complex) Protein, active, 10 µg | Millipore Sigma | 14-476 | Used to phosphorylate Pol II CTD |
| DNA oligonucleotides | IDT | See Table 8 for purity specifications | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Life Technologies Invitrogen | 65001 | We have also used Dynabeads M-280 streptavidin without problem but prefer MyOne Streptavidin beads because they sediment more slowly |
| GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/ml) | Life Technologies Invitrogen | AM9516 | Highly recommended. Dyes nucleic-acid pellet blue making reactions much easier to handle |
| Hoefer SE600 standard dual cooled vertical electrophoresis system with 1 mm spacers and 15 well comb | Hoefer | SE600-15-1.5 | |
| MaXtract high density tubes (1.5 ml) | Qiagen | 129046 | Highly recommended. Contains a high density gel that forms a stable barrier between aqueous and organic phases; improves RNA yields during extractions |
| Proteinase K solution (20 mg/ml) | Life Technologies Invitrogen | 25530049 | |
| RNA oligonucleotides | Trilink | See Table 8 for more details | |
| Yeast Inorganic Pyrophosphatase (100 units/ml) | New England Biolabs | NEBM2403S | Required only during capping reactions |
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