Summary

Visualisering van proteïne kinase een activiteit in hoofd-vaste muizen die in vivo twee-fotonen fluorescentie levensduur beeld microscopie gebruiken

Published: June 07, 2019
doi:

Summary

Een procedure wordt gepresenteerd om te visualiseren van proteïne kinase een activiteiten in hoofd-vaste, gedragen muizen. Een verbeterde A-kinase activiteit Reporter, tAKARα, wordt uitgedrukt in corticale neuronen en toegankelijk gemaakt voorbeeld vorming door middel van een craniaal venster. Two-photon fluorescentie Lifetime Imaging microscopie wordt gebruikt om PKA-activiteiten in vivo te visualiseren tijdens gedwongen motoriek.

Abstract

Neuromodulatie oefent een krachtige controle over de hersenfunctie uit. Dysfunctie van neuromodulatoire systemen resulteert in neurologische en psychiatrische stoornissen. Ondanks hun belang, zijn technologieën voor het bijhouden van neuromodulatoire gebeurtenissen met cellulaire resolutie net begonnen te ontstaan. Neuro modulatoren, zoals dopamine, noradrenaline, acetylcholine, en serotonine, trigger intracellulaire signalering gebeurtenissen via hun respectieve G eiwit-gekoppelde receptoren te moduleren neuronale prikkelbaarheid, synaptische communicatie, en andere neuronale functies, waardoor de informatieverwerking in het neuronale netwerk wordt gereguleerd. De bovengenoemde neuro modulatoren convergeren op het kamp/proteïne kinase A (PKA) traject. Daarom werd in vivo PKA-beeldvorming met eencellige resolutie ontwikkeld als een uitlezen voor neuromodulatoire gebeurtenissen op een manier die analoog is aan calcium beeldvorming voor neuronale elektrische activiteiten. Hierin wordt een methode gepresenteerd om de PKA-activiteit te visualiseren op het niveau van individuele neuronen in de cortex van hoofd-gefixeerde muizen. Om dit te doen, wordt een verbeterde A-kinase activiteit Reporter (AKAR), genaamd tAKARα, gebruikt, die is gebaseerd op Förster Resonance Energy Transfer (FRET). Deze genetisch gecodeerde PKA-sensor wordt in de motorische cortex geïntroduceerd via in utero-elektroporation (IUE) van DNA-plasmiden, of stereotaxic injectie van Adeno-associated virus (AAV). FRET changes worden afgebeeld met behulp van Two-photon fluorescentie Lifetime Imaging microscopie (2pFLIM), dat voordelen biedt ten opzichte van ratiometrische FRET metingen voor het kwantificeren van het FRET signaal in lichtverstrooiing hersenweefsel. Om PKA-activiteiten te bestuderen tijdens gedwongen motoriek, wordt tAKARα afgebeeld via een chronisch craniale venster boven de cortex van wakker, hoofd-vaste muizen, die rennen of rusten op een gemotoriseerde loopband met snelheidscontrole. Deze beeldvormings benadering zal van toepassing zijn op vele andere hersengebieden om overeenkomstige door gedrag geïnduceerde PKA-activiteiten en andere op FLIM gebaseerde sensoren voor in vivo-beeldvorming te bestuderen.

Introduction

Neuromodulatie, ook bekend als langzame synaptische transmissie, legt sterke controle over de hersenfunctie tijdens verschillende gedrags toestanden, zoals stress, opwinding, aandacht, en motoriek1,2,3, 4. ondanks het belang ervan, is de studie van wanneer en waar neuromodulatory gebeurtenissen plaatsvinden nog in de kinderschoenen. Neuro modulatoren, met inbegrip van acetylcholine, dopamine, noradrenaline, serotonine, en vele neuropeptides, activeren G eiwit-gekoppelde receptoren (GPCRs), die op zijn beurt trigger intracellulaire tweede Messenger trajecten met een breed venster van tijdschema’s variërend van seconden tot uren. Terwijl elke neuromodulator activeert een aparte set van signalering van gebeurtenissen, de Camp/proteïne kinase a (PKA) traject is een gemeenschappelijk stroomafwaarts traject voor vele neuro modulatoren1,5. De Camp/pKa traject regelt neuronale prikkelbaarheid, synaptische transmissie, en plasticiteit6,7,8,9, en daarom, stemt de neuronale netwerk dynamiek. Omdat verschillende neuronen of neuronale typen Express verschillende soorten of niveaus van neuromodulator receptoren10, de intracellulaire effecten van de dezelfde extracellulaire neuromodulator kunnen heterogenen over verschillende neuronen, en dus, moeten worden bestudeerd met cellulaire resolutie. Tot nu toe, het blijft uitdagend om te controleren van neuromodulatory gebeurtenissen in individuele neuronen in vivo tijdens gedrag.

Om de spatiotemporele dynamiek van neuromodulatie te bestuderen, is een geschikte opname modaliteit vereist. Microdialyse en Fast-scan cyclische voltammetrie worden vaak gebruikt voor het bestuderen van de release van neuro modulatoren, maar ze missen de ruimtelijke resolutie voor het bewaken van cellulaire gebeurtenissen11,12. Analoog aan calcium dynamica wordt gebruikt als een proxy voor neuronale elektrische activiteit in de populatie Imaging13, pKa Imaging kan worden gebruikt om te lezen neuromodulatory gebeurtenissen over een neuronale populatie bij cellulaire resolutie. Het huidige protocol beschrijft het gebruik van een verbeterde A-kinase activity Reporter (AKAR) om PKA-activiteiten in vivo te monitoren tijdens het gedrag van dieren. De hier beschreven methode zorgt voor gelijktijdige beeldvorming van neuronale populaties op subcellulaire resolutie met een tijdelijke resolutie die fysiologische neuromodulatoire gebeurtenissen bijhoudt.

Akars zijn samengesteld uit een donor en een acceptor fluorescerende eiwitten gekoppeld door een pKa fosforylatie substraat peptide en een Forkhead geassocieerde (FHA) domein dat bindt aan de fosforylated serine of Threonine van de ondergrond14,15. Na activering van het PKA-traject is de substraat Peptide van AKAR gefosforyleerd. Dientengevolge, het FHA domein bindt aan de fosforylated substraat peptide, waardoor de twee fluor Foren in de nabijheid, aangeduid als de gesloten staat van AKAR. De gesloten toestand van een gefosforyleerd AKAR resulteert in verhoogde Förster Resonance Energy Transfer (FRET) tussen de donor en acceptor fluophores. Aangezien het aandeel fosforylated akars gerelateerd is aan het niveau van PKA-activiteit16, kan de hoeveelheid fret in een biologisch monster worden gebruikt om het niveau van PKA-activiteit16,17,18te kwantificeren, 19,20.

Vroege versies van AKARs werden voornamelijk ontworpen voor tweekleurige ratiometrische beeldvorming14. Bij beeldvorming dieper in hersenweefsel lijdt de ratiometrische methode aan signaalvervorming als gevolg van golflengte afhankelijke lichtverstrooiing17,18,21. Zoals hieronder besproken, elimineert fluorescentie Lifetime Imaging microscopie (flim) dit probleem omdat flim alleen fotonen meet die worden uitgezonden door de donor de18,21. Hierdoor wordt de FLIM kwantificering van FRET niet beïnvloed door de weefsel diepte17. Daarnaast kan een “donkere” (d.w.z. lage kwantum opbrengst [QY]) variant van de acceptor de worden gebruikt. Dit bevrijdt een kleurkanaal om Multiplexed meting van orthogonale neuronale eigenschappen mogelijk te maken via gelijktijdige beeldvorming van een tweede sensor of een morfologische marker17,19,20.

Flim Imaging kwantificeert de tijd dat een de in de opgewonden toestand doorbrengt, d.w.z. de fluorescentie levensduur18. De terugkeer van een de naar de grond staat, dus het einde van de opgewonden toestand, vaak gelijktijdig met de uitstoot van een foon. Hoewel de emissie van een foon voor een individueel opgewonden molecuul stochastisch is, is de gemiddelde fluorescentie levensduur een kenmerk van die specifieke fluorophore. Wanneer een zuivere populatie fluoroforen tegelijkertijd opgewonden is, zal de resulterende fluorescentie één exponentieel verval volgen. De tijds constante van dit exponentiële verval komt overeen met de gemiddelde fluorescentie levensduur, die meestal varieert van één tot vier nanoseconden voor fluorescerende eiwitten. De terugkeer van een opgewonden donor de naar de grond staat kan ook voorkomen door fret. In aanwezigheid van fret wordt de fluorescentie levensduur van de donor de verlaagd. De ongefosforyleerde AKARs vertonen een relatief langere levensduur van de donor fluorescentie. Na fosforylering door PKA vertoont de sensor een kortere levensduur omdat de donor-en acceptor-fluoroforen in de buurt van elkaar worden gebracht en de FRET toeneemt. De kwantificering van de fluorescentie levensduur in een populatie van AKARs vertegenwoordigt daarom het niveau van PKA activiteit.

Vroege versies van AKARs zijn niet met succes gebruikt voor in vivo beeldvorming bij eencellige resolutie. Dit is voornamelijk te wijten aan de lage signaalamplitude van de AKAR-sensoren voor fysiologische activaties17. Onlangs, door het systematisch vergelijken van beschikbare AKAR-sensoren voor twee-Fobe fluorescentie levensduur beeldvormings microscopie (2pFLIM), werd een sensor genaamd FLIM-AKAR gevonden om beter te presteren dan alternatieve sensoren. Bovendien werden een reeks FLIM-AKAR varianten genaamd targeted AKARs (tAKARs) ontwikkeld om de PKA activiteit te visualiseren op specifieke subcellulaire locaties: microtubuli (tAKARα), cytosol (tAKARβ), actine (takarδ), filamenteuze actine (takarε), membraan (tAKARγ), en postsynaptische dichtheid (Takari). Onder tAKARs, tAKARα verhoogde de amplitude van het signaal opgewekt door noradrenaline door 2,7-fold. Dit is in overeenstemming met de kennis dat de meerderheid van pKa in neuronen zijn verankerd aan microtubuli in rusttoestand22,23. tAKARα was de beste performer onder bestaande AKARs voor 2pFLIM. Bovendien, tAKARα gedetecteerd fysiologisch relevante PKA activiteit opgewekt door meerdere neuro modulatoren, en de uitdrukking van tAKARα veranderd neuronale functies17.

Onlangs werd tAKARα met succes gebruikt om PKA-activiteiten te visualiseren in Head-Fixed met muizen17. Er werd aangetoond dat gedwongen motoriek de PKA-activiteit veroorzaakte in het SOMA van de oppervlakkige laag neuronen (laag 1 tot en met 3, tot een diepte van ~ 300 μm van Pia) in de motor, het vat en de visuele cortices. De motoriek-geactiveerde PKA activiteit was deels afhankelijk van signalering via β-adrenerge receptoren en D1 dopamine receptoren, maar werd niet beïnvloed door een D2 dopamine receptor antagonist. Dit werk illustreert het vermogen van tAKARs om neuromodulatie-gebeurtenissen in vivo te volgen met behulp van 2pFLIM.

In het huidige protocol wordt de gehele methode voor PKA-activiteit beeldvorming in in het hoofd vaste wakker muizen tijdens een afgedwongen bewegings paradigma beschreven in zes stappen. Ten eerste, de toevoeging van 2pFLIM-capaciteiten aan een conventionele twee-Fobe Microscoop (Figuur 1). Ten tweede, de aanleg van een gemotoriseerde loopband (Figuur 2). Ten derde, de uitdrukking van de tAKARα-sensor in de cortex van de muis door in utero-elektroporation (IUE) van DNA-plasmiden, of stereotaxus injectie van Adeno-associated virus (AAV). Uitstekende protocollen voor operaties voor iue24,25 en stereotaxic injectie van virale deeltjes26 zijn eerder gepubliceerd. De belangrijkste parameters die we gebruikten, worden hieronder beschreven. De installatie van een craniaal venster. Uitstekende protocollen zijn eerder gepubliceerd voor craniale Window chirurgie27,28. Verschillende stappen die zijn gewijzigd van de standaardprotocollen worden beschreven. Ten vijfde, presteren in vivo 2pFLIM. Zesde, de analyses van 2pFLIM beelden (Figuur 3 en Figuur 4). Deze aanpak moet gemakkelijk toepasbaar zijn op vele andere hoofd-vaste gedrags paradigma’s en hersengebieden.

Protocol

Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) van Oregon Health and Science University. 1.2pFLIM Microscoop Setup Installeer een foton timing tellings module (ptcm, tabel met materialen) en maak verbinding met de computer (Figuur 1) volgens de handleiding van de fabrikant.Opmerking: De ptcm is meestal een computer bord dat een “Sync” input ontvangt voor …

Representative Results

FRET-FLIM-sensoren zorgen voor de visualisatie van vele verschillende signalerings trajecten, waaronder het cAMP/PKA-traject dat betrokken is bij neuromodulatie. Het huidige protocol maakt gebruik van de recent ontwikkelde tAKARα-sensor in combinatie met 2pFLIM om PKA-activiteiten te visualiseren in hoofd-gefixeerde muizen. De meeste bestaande twee-photon-microscopen kunnen worden geüpgraded met 2pFLIM-mogelijkheden door drie tot vier componenten toe te voegen, zoals geïllustreerd in <…

Discussion

Dit protocol demonstreert het gebruik van FRET-FLIM-sensor tAKARα om neuromodulatie-geactiveerde PKA-activiteit in hoofd-vaste muizen te visualiseren. Deze toepassing is gebaseerd op uitgebreide tests en karakterisaties van tAKARα in vitro en in vivo om aan te tonen dat het verkregen FLIM-signaal relevant is voor fysiologische neuromodulatoire gebeurtenissen17. Hier wordt een in vivo toepassing, motorische geïnduceerde PKA-activiteit in de motorische cortex, gebruikt om de procedures te beschri…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij danken mevrouw Tess J. Lameyer, mevrouw Ruth Frank, en Dr. Michael A. Muniak voor bewerkingen en commentaren, en Dr. Ryohei Yasuda bij Max Planck Florida voor 2pFLIM acquisitie software. Dit werk werd gesteund door twee BRAIN Initiative Awards U01NS094247 (H.Z. en T.M.) en R01NS104944 (H.Z. en T.M.), een R01 Grant R01NS081071 (T.M.), en een R21 Grant R21NS097856 (H.Z.). Alle prijzen zijn afkomstig van het Nationaal Instituut voor neurologische aandoeningen en beroerte, Verenigde Staten.

Materials

0.2 μm cellulose acetate syringe filter Nalgene 190-2520 Step 3.2.2.
16x 0.8 NA water-immersion objective Nikon MRP07220 Step 5.5.
3-pin cable US digital CA-MIC3-SH-NC Step 2.5. To connect rotation sensor to the DAQ input of the microscope
Aluminum bread board Thorlabs MB1012 Step 2.5.
AnimalTracker MATLAB software N/A N/A Step 2.5 and sections 5 – 6. Will be provided upon request to the lead author
Band-pass barrier filter Chroma ET500-40m Step 1.4.
Cage plate Thorlabs CP01 Step 2.4. Used as mount for rotation sensor
Carbon steel burrs for micro drill, 0.5 mm tip diameter FST 19007-05 Steps 3.2.3. and 4.4.
Circular coverslip (5mm diameter) VWR 101413-528 Step 4.5.
Custom-made injection needle holder N/A N/A Step 3.2.4. Technical details provided upon request to the lead author
Dental acrylic Yates Motloid 44114 Steps 4.3. and 4.5.
Dental drill; Microtorque ii Ram products 66699 Steps 3.2.3. and 4.4.
Dowsil transparent polymer The Dow Chemical Company 3-4680 Step 4.5. Artificial dura
Electroporation electrode Bex LF650P5 Step 3.1.4.
Electroporator Bex CUY21 Step 3.1.4.
Fast green FCF Sigma-aldrich F7258-25G Step 3.1.1.
FLIMimage MATLAB software N/A N/A Section 5. Kindly provided by Dr. Ryohei Yasuda, Max Planck Florida
FLIMview MATLAB software N/A N/A Sections 5. and 6. Will be provided upon request to the lead author
Foam-compatible glue (Gorilla White Glue) Gorilla 5201204 Step 2.3.
Headplate N/A N/A Step 4.3. Technical details provided upon request to the lead author
Headplate holder N/A N/A Step 2.6. Technical details provided upon request lead author, used in combination with mounting post bracket and right-angled bracket
Hydraulic micromanipulator Narishige MO-10 Step 3.2.4.
Krazy glue Krazy glue KG82648R Step 4.3. Cyanoacrylate-based glue
Low-noise fast photomultiplier tube Hamamatsu H7422PA-40 or H10769PA-40 Step 1.3.
MATLAB 2012b Mathworks N/A Steps 2.6, and sections 5, and 6. Used to run microscope acquisition and data analysis software
Motor Zhengke ZGA37RG Step 2.4.
Motor speed controller Elenker EK-G00015A1-1 Step 2.5.
Motorized micromanipulator Sutter MP-285 Step 3.2.4.
Mounting base Thorlabs BA1S Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with PH4 and TR2
Mounting post Thorlabs P14 Step 2.6. Used for headplate holder post in combination with PB2
Mounting post base Thorlabs PB2 Step 2.6. Used for headplate holder post in combination with P14
Mounting post bracket Thorlabs C1515 Step 2.6. Used in combination with right-angle bracket and headplate holder
Optical post Thorlabs TR2 Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with BA1S and PH4
Phosphate-buffered saline Ν/Α Ν/Α Step 3.2.2. Protocol: Cold Spring Harbor Protocols 2006, doi: 10.1101/pbd.rec8247
Photodiode Thorlabs FDS010 Step 1.2.
Photon timing counting module Becker and Hickl SPC-150 Step 1.1.
Plasmid: tAKARα (CAG-tAKARα-WPRE) Addgene 119913 Step 3.1.3.
Post holder Thorlabs PH4 Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with BA1S and TR2
Right-angle bracket Thorlabs AB90 Step 2.6 Used in combination with mounting post bracket and headplate holder
Rotation sensor US digital MA3-A10-250-N Step 2.4.
Rubber mat Rubber-Cal B01DCR5LUG Step 2.1.
Shaft coupling (1/4 inch x 1/4 inch) McMaster 6208K433 Steps 2.3. and 2.4.
ScanImage 3.6 Svoboda Lab/Vidrio Technology N/A Steps 5.9. and 6.1.
Signal splitter Becker and Hickl HPM-CON-02 Step 1.3.1.
Stainless steel axle (diameter 1/4 inch, L = 12 inch) McMaster 1327K66 Step 2.3.
Stereotaxic alignment systsem David kopf 1900 Steps 3.2. and 4.1. modified; Sutter micromanipulator, custom-made injection needle holder, hydraulic micromanipulator
Two-photon microscope N/A N/A Section 5. Built based on Modular in vivo multiphoton microscopy system (MIMMS) from HHMI Janelia Research Campus (https://www.janelia.org/open-science/mimms)
Vetbond tissue adhesive 3M 14006 Step 3.2.6.
Virus: tAKARα (AAV2/1 hSyn-tAKARα-WPRE) Addgene 119921 Step 3.2.2.
White PE foam roller (8 x 12 inch) Fabrication enterprises INC. 30-2261 Step 2.1.1.
White polystyrene fom ball halves GrahamSweet 200mm diameter 2 hollow halves Step 2.1.1.
Zipkicker PACER PT29 Step 4.3. Hardening accelerator

References

  1. Greengard, P. The Neurobiology of Slow Synaptic Transmission. Science. 294 (5544), 1024-1030 (2001).
  2. Petersen, S. E., Posner, M. I. The attention system of the human brain: 20 years after. Annual Review of Neuroscience. 35 (2), 73-89 (2012).
  3. Sun, Y., Hunt, S., Sah, P. Norepinephrine and Corticotropin-Releasing Hormone: Partners in the Neural Circuits that Underpin Stress and Anxiety. Neuron. 87 (3), 468-470 (2015).
  4. Berke, J. D. What does dopamine mean?. Nature Neuroscience. 21 (6), 787-793 (2018).
  5. Chen, Y., et al. Endogenous Gαq-Coupled Neuromodulator Receptors Activate Protein Kinase A. Neuron. 96 (5), 1070-1083 (2017).
  6. Madison, D. V., Nicoll, R. A. Cyclic adenosine 3’,5’-monophosphate mediates beta-receptor actions of noradrenaline in rat hippocampal pyramidal cells. The Journal of Physiology. 372 (1), 245-259 (1986).
  7. Yasuda, H., Barth, A. L., Stellwagen, D., Malenka, R. C. A developmental switch in the signaling cascades for LTP induction. Nature Neuroscience. 6 (1), 15-16 (2003).
  8. Pedarzani, P., Storm, J. F. PKA mediates the effects of monoamine transmitters on the K+ current underlying the slow spike frequency adaptation in hippocampal neurons. Neuron. 11 (6), 1023-1035 (1993).
  9. Brandon, E. P., Idzerda, R. L., McKnight, G. S. PKA isoforms, neural pathways, and behaviour: making the connection. Current Opinion in Neurobiology. 7 (3), 397-403 (1997).
  10. Radnikow, G., Feldmeyer, D. Layer- and Cell Type-Specific Modulation of Excitatory Neuronal Activity in the Neocortex. Frontiers in Neuroanatomy. 12 (January), (2018).
  11. Kennedy, R. T. Emerging trends in in vivo neurochemical monitoring by microdialysis. Current Opinion in Chemical Biology. 17 (5), 860-867 (2013).
  12. Rodeberg, N. T., Sandberg, S. G., Johnson, J. A., Phillips, P. E. M., Wightman, R. M. Hitchhiker’s Guide to Voltammetry: Acute and Chronic Electrodes for In Vivo Fast-Scan Cyclic Voltammetry. ACS Chemical Neuroscience. 8 (2), 221-234 (2017).
  13. Hamel, E. J. O., Grewe, B. F., Parker, J. G., Schnitzer, M. J. Cellular level brain imaging in behaving mammals: An engineering approach. Neuron. 86 (1), 140-159 (2015).
  14. Allen, M. D., Zhang, J. Subcellular dynamics of protein kinase A activity visualized by FRET-based reporters. Biochemical and Biophysical Research Communications. 348 (2), 716-721 (2006).
  15. Zhang, J., Ma, Y., Taylor, S. S., Tsien, R. Y. Genetically encoded reporters of protein kinase A activity reveal impact of substrate tethering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (26), 14997-15002 (2001).
  16. Chen, Y., Saulnier, J. L., Yellen, G., Sabatini, B. L. A PKA activity sensor for quantitative analysis of endogenous GPCR signaling via 2-photon FRET-FLIM imaging. Frontiers in Pharmacology. 5 (April), 1-12 (2014).
  17. Ma, L., et al. A Highly Sensitive A-Kinase Activity Reporter for Imaging Neuromodulatory Events in Awake Mice. Neuron. 99 (4), 665-679 (2018).
  18. Yellen, G., Mongeon, R. Quantitative two-photon imaging of fluorescent biosensors. Current Opinion in Chemical Biology. 27, 24-30 (2015).
  19. Tang, S., Yasuda, R. Imaging ERK and PKA Activation in Single Dendritic Spines during Structural Plasticity. Neuron. 93 (6), 1315-1324 (2017).
  20. Tillo, S. E., et al. Liberated PKA Catalytic Subunits Associate with the Membrane via Myristoylation to Preferentially Phosphorylate Membrane Substrates. Cell Reports. 19 (3), 617-629 (2017).
  21. Yasuda, R. Imaging spatiotemporal dynamics of neuronal signaling using fluorescence resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy. Current Opinion in Neurobiology. 16 (5), 551-561 (2006).
  22. Theurkauf, W. E., Vallee, R. B. Molecular characterization of the cAMP-dependent protein kinase bound to microtubule-associated protein 2. Journal of Biological Chemistry. 257 (6), 3284-3290 (1982).
  23. Zhong, H., et al. Subcellular dynamics of type II PKA in neurons. Neuron. 62 (3), 363-374 (2009).
  24. Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. Journal of Neuroscience Methods. 143 (2), 151-158 (2005).
  25. Baumgart, J., Baumgart, N. Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse. Journal of Visualized Experiments. (107), e53303 (2016).
  26. Lowery, R. L., Majewska, A. K. Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors. Journal of Visualized Experiments. (45), 1-4 (2010).
  27. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. Journal of Visualized Experiments. (12), 18-19 (2008).
  28. Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
  29. Murakoshi, H., Lee, S. J., Yasuda, R. Highly sensitive and quantitative FRET-FLIM imaging in single dendritic spines using improved non-radiative YFP. Brain Cell Biology. 36 (1-4), 31-42 (2008).
  30. Murakoshi, H., Shibata, A. C. E., Nakahata, Y., Nabekura, J. A dark green fluorescent protein as an acceptor for measurement of Förster resonance energy transfer. Scientific Reports. 5, 1-11 (2015).
  31. Guo, Z. V., et al. Procedures for behavioral experiments in head-fixed mice. PLoS ONE. 9 (2), (2014).
  32. Yu, K., et al. The central amygdala controls learning in the lateral amygdala. Nature Neuroscience. 20 (12), 1680-1685 (2017).
  33. Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation. Nature. 461 (7266), 941-946 (2009).
  34. Yasuda, R. Imaging intracellular signaling using two-photon fluorescent lifetime imaging microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 7 (11), 1121-1128 (2012).
  35. Mehta, S., et al. Single-fluorophore biosensors for sensitive and multiplexed detection of signalling activities. Nature Cell Biology. 20 (10), 1215-1225 (2018).

Play Video

Cite This Article
Jongbloets, B. C., Ma, L., Mao, T., Zhong, H. Visualizing Protein Kinase A Activity In Head-fixed Behaving Mice Using In Vivo Two-photon Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy. J. Vis. Exp. (148), e59526, doi:10.3791/59526 (2019).

View Video