Summary
Vi beskriver här en flödescytometri-baserad in vivo dödande analys som möjliggör undersökning av immunodominans i cytotoxiska T-lymfocyter (CTL) svar på en modell tumör antigen. Vi ger exempel på hur denna eleganta analys kan vara anställd för mekanistiska studier och för läkemedels effekt testning.
Abstract
Carboxyfluorescein succinimidylester (cfse)-baserade in vivo cytotoxicitet analyser möjliggöra känslig och noggrann kvantitation av CD8+ cytolytisk T lymfocyt(CTL) svar framkallas mot tumör-och patogen-härledda peptider. De erbjuder flera fördelar jämfört med traditionella dödande analyser. Först, de tillåter övervakning av CTL-medierad cytotoxicitet inom arkitektoniskt intakt sekundära lymfoida organ, typiskt i mjälte. För det andra, de tillåter mekanistiska studier under priming, effektor och återkalla faser av CTL svar. För det tredje, de ger användbara plattformar för vaccin/läkemedels effekt testning i en verkligt in vivo-inställning. Här ger vi ett optimerat protokoll för undersökning av samtidiga CTL svar mot mer än en peptid epitop av en modell tumör antigen (AG), nämligen, Simian virus 40 (SV40)-kodade stora T AG (T AG). Liksom de flesta andra kliniskt relevanta tumör proteiner, T AG hamnar många potentiellt immunogena peptider. Emellertid, endast fyra sådana peptider inducera detekterbara CTL svar i C57BL/6 möss. Dessa svar är genomgående ordnade i en hierarkisk ordning baserat på deras storlek, som utgör grunden för TCD8 "immunodominans" i detta kraftfulla system. Följaktligen är merparten av t AG-specifika tCD8 svar fokuserat mot en enda immundominerande epitop medan de andra tre epitoper erkänns och svarade endast svagt. Immunodominans äventyrar bredden av antitumöreffekt TCD8 svar och är, som sådan, anses av många som ett hinder för framgångs rik vaccination mot cancer. Därför, det är viktigt att förstå de cellulära och molekyl ära faktorer och mekanismer som dikterar eller formar TCD8 immunodominans. Det protokoll vi beskriver här är skräddarsytt för utredning av detta fenomen i T AG immunisering modell, men kan lätt modifieras och utvidgas till liknande studier i andra tumör modeller. Vi ger exempel på hur effekten av experimentella immunterapeutiska interventioner kan mätas med in vivo cytotoxicitetsanalyser.
Introduction
Konventionella CD8+ t-celler (tCD8) spela viktiga delar i cancer immun övervakning. De fungerar främst i kapaciteten hos cytolytiska T-lymfocyter (CTL) som erkänner tumörspecifika eller-associerade peptid antigener (AGS) visas inom den slutna spalten av större histocompatibility complex (MHC) klass I molekyler. Fullt beväpnade CTL använder sin cytotoxiska arsenal för att förstöra maligna celler. Mot cancer TCD8 kan upptäckas i cirkulationen eller ens inne primära och metastaserande massor av många cancer patienter och tumör-bärande djur. Emellertid, de är ofta anergic eller utmattad och Miss lyckas med att utrota cancer. Därför, många immunterapeutiska metoder är utformade för att öka cancer TCD8 frekvenser och för att återställa och öka deras funktioner.
Tumör proteiner hamn många peptider, av vilka några kan vara immunogena och potentiellt immunoprotective. Emellertid, kvantifierbara TCD8 svar framkallas med varierande magnituder mot endast några peptider. Detta skapar en "immunodominans hierarki" bland TCD8 kloner1. Följaktligen, immundominerande (ID) TCD8 ockupera framstående hierarkiska leden, som ofta bedöms av deras överflöd. I kontrast, tCD8 celler vars t cell receptor (TCR) är specifik för Subdominant (SD) epitoper förekommer i lägre frekvenser. Vi och andra har identifierat några av de faktorer som dikterar eller forma immunodominans i TCD8 svar. Dessainkluderar bland annat läge AG presentation till naiva TCD8 (dvs., direkt presentation, cross-presentation, cross-dressing)2,3,4, den typ av AG-presenterande celler (APCS) deltar i TCD8 aktivering5, överflöd och stabilitet av protein AGS6,7 och effektivitet och kinetik av deras nedbrytning av proteasomer7,8, den relativ selektivitet av transportör i samband med AG Processing (TAP) för peptider9, affinitet av befriade peptider för MHC i molekyler9,10, närvaron, föregångare frekvenser och TCR mångfald av besläktat tCD8 i t-cellspooler11,12,13, cross-konkurrens mellan T-celler för till gång till APCS14,15, och brödra kapacitet av TCD8 kloner16. Dessutom är TCD8 immunodominans utsätts för immunoregulatoriska mekanismer medieras av flera suppressor cell typer såsom naturligt förekommande regulatoriska T (nTreg) celler17, cellytan co-hämmande molekyl programmerad död-1 (PD-1)16, och vissa intracellulära enzymer såsom indoleamin 2, 3-dioxygenas (Ido)18 och däggdjurs målet för Rapamycin (mTOR)19. Det är dock viktigt att notera att ovanstående faktorer inte alltid fullt ut står för immunodominans.
Bortsett från den grundläggande biologi av TCD8 immunodominans, undersökning av denna spännande fenomen har viktiga konsekvenser i cancer immunologi och immun terapi. Först, en ID-status inte nödvändigt vis ge en given TCD8 klon förmågan att förhindra tumör initiering eller progression20. Om och hur ID och SD TCD8 bidra till antitumöreffekt immunitet kan vara beroende av vilken typ och omfattningen av malignitet och det experimentella systemet används. För det andra, det är tänkt att ID TCD8 kloner kan vara "alltför synlig" till immun försvaret och därmed mer benägna att centrala och/eller perifera tolerans mekanismer16,21. Tredje, heterogena tumörer kan innehålla neoplastiska celler som undviker upptäckt av många, om inte de flesta, CTL genom att visa endast ett smalt spektrum av peptid: MHC komplex. Under dessa omständigheter, TCD8 svar av otillräcklig bredd är sannolikt att ge sådana tumör celler en överlevnad fördel, vilket potentierar deras utväxt22. Det är av ovanstående skäl som många ser immunodominans som ett hinder för framgångs rik TCD8-baserad vaccination och terapier mot cancer.
Inympning av C57BL/6 möss med Simian virus 40 (SV40)-omvandlas celler som uttrycker stora tumör AG (T AG) ger ett kraftfullt prekliniska system för att studera TCD8 immunodominans. Denna modell erbjuder flera fördelar. Först, peptid epitoper av denna kliniskt relevanta onkoprotein är väl kännetecknas i denna mus stam23 (tabell 1). För det andra, T AG epitopes, som kallas platser I, II/III, IV, och V, utlösa TCD8 svar som konsekvent arrangeras i följande hierarkiska ordning: plats iv > > plats i ≥ plats II/iii > ≫ plats V. Följaktligen, plats IV-specifika TCD8 montera den mest robusta responsen på T AG. I motsats, platser i och II/III är Subdominant, och plats V-specifika TCD8 är minst riklig och oftast bara upptäckas i avsaknad av lyhördhet för andra epitoper23,24. Tredje, T AG+ tumör cellinjen används i protokollet som beskrivs häri, nämligen C57SV fibrosarkom celler, och de som används i våra tidigare undersökningar16,17,18,19 ,25,26, transformeras med subgenomic SV40 fragment25. Därför, de är oförmögna att montera och släppa SV40 virioner som potentiellt kan infektera värd APCs. Dessutom, C57SV celler saknar klassiska stimulatoriska molekyler som CD80 (B7-1), CD86 (B7-2), och CD137 ligand (4-1bbl)16. Ovanstående attribut gör dessa linjer idealiska för undersökning av in vivo TCD8 aktivering via Cross-priming. Cross-priming är en viktig väg att framkalla TCD8 svar, särskilt de som inletts mot tumör celler av icke-hematopoetiska ursprung som inte direkt Prime naiva t-celler25.
Antitumöreffekt TCD8 frekvenser och/eller funktioner kan övervakas av MHC jag propylentetramer färgning, intracellulär färgning för effektor cytokiner (t. ex., interferon [IFN]-γ) eller lytiska molekyler (t. ex. perforin), enzymlänkade Immunospot (ELISpot) analyser och ex -analyser av cytotoxicitet. Sedan starten på 1990-talet27,28, carboxyfluorescein succinimidylester (cfse)-baserade in vivo dödande analyser har möjliggjort utvärdering av cytotoxiska svar medierade av antiviral ctls29,30 , 31, antitumöreffekt ctls16,32, Natural Killer (nk) celler33, glykolipid-reaktivt invariant naturliga mördare T (inkt) celler34, och redan existerande och de Novo givar-specifika alloantikroppar26. Därför kan deras ansökningar vara av intresse för en bred läsekrets, inklusive men inte begränsat till utredare som arbetar inom områdena tumör immunologi och immunoterapi, anti-patogen immunitet, och förebyggande och terapeutiska vaccin design.
För att bedöma Cell-medierad cytotoxicitet i typiska scenarier, två populationer av naiva splenocyter som uppvisar antingen en irrelevant AG eller en besläktat AG (s) är märkta med två olika doser av cfse, blandat i lika många och injiceras i naiva (kontroll) eller mördare cell-hysa möss. Närvaron/frånvaron av varje mål population unders öks sedan genom flödescytometri.
Vi har optimerat och använt in vivo dödande analyser i våra studier om immunodominans i både antivirala och antitumöreffekt TCD8 svar12,16,17. Här ger vi ett detaljerat protokoll för samtidig bedömning av ID och SD TCD8 svar på T AG epitopes, som lätt kan antas för liknande undersökningar i andra experimentella system. Vi ger också representativa resultat som visar att nTreg cell utarmning och PD-1 blockad kan selektivt förbättra ID TCD8-och SD TCD8-inducerad cytotoxicitet, respektive. I slutet kommer vi att diskutera flera fördelar med in vivo dödande analyser samt några av deras inneboende begränsningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De experiment som beskrivs här följer de protokoll för djur användning som godkänts av institutionella enheter och som följs av fastställda nationella rikt linjer.
1. inokulering av C57BL/6 möss med T AG-uttryck tumör celler
- Odla SV40-transformerade fibrosarkom cellinjen C57SV (eller en liknande T AG+ anhängare cellinjen) i Dulbecco modifierade Eagle ' s medium (DMEM) med 4,5 g/l D-glukos och L-glutamin (1x) och kompletteras med 1 mm natrium Pyruvat och 10% Värmeinaktiverade fosterbovint serum (FBS) i vävnadsbehandlade kolvar vid 37 ° c i befuktad atmosfär innehåll ande 10% CO2.
- När cellerna blivit helt konflytande eller något överkonflytande, försiktigt bort och kassera mediet och skölj enskiktslager med pre-uppvärmda sterila fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
Obs: maximal T AG-uttryck uppnås när T AG+ celler når 100% sammanlänkning. - I ett biologiskt säkerhets skåp, tillsätt förvärmda trypsin-EDTA (0,25%) för att täcka enskiktslager vid rums temperatur tills cellerna är avlämnade i fläckar. Knacka på sidorna av kulturkolven flera gånger för att frigöra de återstående ansittande cellerna.
Anmärkning: om nödvändigt och för att påskynda trypsiniseringsprocessen, överför kolven till en inkubator med 37 ° c. Disingade celler kommer snabbt att anta en rundad form under ett lätt Mikroskop. Detta steg bör pågå ca 5 min. - Tillsätt 5 mL DMEM-medium och separera klumpar för att bereda en encellig SUS pension genom att Pipettera innehållet i varje kolv upp och ner.
- Överför cell SUS pensionen genom en cellsil med 70-μm porer till ett rör.
- Snurra röret på 400 x g i 5 min vid 4 ° c.
- Kassera supernatanten. Omsuspendera pelleterade celler i 10 mL steril kall PBS.
- Upprepa steg 1,6 och 1,7 två gånger.
- Räkna celler med en hemocytometer. Bered en enhetlig SUS pension innehåll ande 4 x 107 celler/ml steril PBS.
- Injicera 500 μL av ovanstående SUS pension intraperitonealt (i.p.) i varje vuxen (6-12-veckors-gammal) manlig eller kvinnlig C57BL/6-mus.
2. behandlingsregimer
-
Behandlingsregim att undersöka bidraget av nTreg celler till TCD8 immunodominans
- Fyra dagar före in vivo-priming av C57BL/6-möss med C57SV-celler (steg 1,10) ska varje djur injiceras en gång med 0,5 mg av en låg-endotoxin, azidfri anti-CD25 monoklonal anti kropp (mAb) (klon PC-61.5.3), som utarmar nTreg-celler, eller med en råtta IgG1 (t. ex. klon KLH/G1-2-2, klon HRPN eller klon TNP6A7).
-
Behandlingsregim för att testa in vivo signifikans av PD-1-PD-L1 (2) interaktioner i forma TCD8 immunodominans
Anmärkning: engagemanget av PD-1 av PD-L1 ofta, men inte alltid, förmedlar co-hämning och/eller utmattning av AG-specifik TCD8. Därför kan behandling med anti-PD-1 utföras parallellt med administrering av anti-PD-L1 och anti-PD-L2 mAbs för att avslöja den exakta intercellulära interaktionen inblandade i ett biologiskt fenomen.
3. beredning av mål Splenocyter
- Euthanize sex-matchade naiva C57BL/6 möss (6-12 veckors ålder) som kommer att fungera som splenocyt donatorer av cervikal disloksering.
- Placera varje mus med buken vänd uppåt inuti ett biologiskt säkerhets skåp. Spraya huden med 70% (v/v) EtOH. Med hjälp av sterila pincett och sax, lyfta huden och göra en liten ventrala mitt linjen snitt. Sedan, skär huden i ett kors-liknande sätt att exponera bukhinnan.
- Med hjälp av pincett, dra upp bukhinnan i ett tält-liknande sätt utan att rycka någon av de inre organen. Skär bukhinnan öppna för att exponera peritonealhålan och försiktigt bort mjälte.
- Placera mjälten (s) i en 15 mL Dounce Tissue Grinder innehåller 5 mL steril PBS. Applicera manuellt tryck med hjälp av den malnings glas kolven tills mjältrespappret avleds till en röd homogen cell SUS pension.
Beroende på antalet mottagar djur per försöks grupp kan flera givar mus mjälte behövas för förberedelse av mål celler. Upp till 3 mjälte kan homogeniseras tillsammans i en 15 ml kvarn. - Överför Homogenatet till ett 15 mL-rör. Snurra röret på 400 x g i 5 min vid 4 ° c.
- Kassera supernatanten. Omsuspendera pelleterade celler i 4 mL ammoniumklorid-kalium (ACK) lyseringslösning buffert för 4 min att eliminera erytrocyter.
Obs: detta är ett tids känsligt steg. Överexponera splenocyter till ACK lyseringslösning buffert kommer att öka deras bräcklighet och göra dem mottagliga för icke-specifik celldöd. - Tillsätt 8 mL RPMI 1640 medium som innehåller 10% Värmeinaktiverade FBS, L-alanyl-L-glutamin, 0,1 mM minimum essentiella medier (MEM) icke essentiella aminosyror, 1 mM natriumpyruvat, 10 mM HEPES och 1x penicillin/streptomycin, som härefter kommer att kallas komplett RPMI-medium (material tabell).
- Överför innehållet genom 70 μm porer i en cell sil till en ny 15 mL tub.
- Snurra röret på 400 x g i 5 min vid 4 ° c.
- Kassera supernatanten. Omsuspendera pelleterade celler i 12 mL komplett RPMI.
- Dela upp splenocytsus pensionen i 3 lika stora portioner (4 mL vardera) i 3 separata tuber.
4. Coating mål Splenocyter med irrelevant och cognate peptider
- Märk rören enligt de peptider som kommer att användas för att pulsera mål splenocyter. Kontroll splenocyter kommer att pulseras med en irrelevant peptid, och varje population av kognate mål splenocyter kommer att pulsas med en syntetisk peptid som motsvarar T AG-derived immundominerande epitop (plats IV) eller en Subdominant T AG epitop (plats I eller plats II/III) (tabell 1).
Anmärkning: valet av irrelevanta peptider beror på den experimentella set-up och musen stam som används i varje undersökning. Författarna använder ofta GB498-505 (en h-2kb-begränsad immundominerande peptid epitop av herpes simplex-virus [HSV]-1) och/eller GP33-41 (en h-2Db-begränsad immundominerande peptid epitop av Lymfocytisk ([LCMV]) hos C57BL/6-möss (tabell 1). Dessa peptider är optimala val eftersom: (i) de härrör från patogener som inte tidigare stött på mus modell som beskrivs här; (II) liknar T AG-härledda peptider, gB498-505 och GP33-41 är begränsade av och binder till H-2b -molekyler. I "Three-Peak" in vivo-dödande analyser kan var och en av de två topparna som motsvarar de kognate mål cellerna representera splenocyter pulsad med en immundominerande eller Subdominant peptid. Valet av varje peptid uppsättning varierar beroende på målen för varje experiment. Se figur 1 och figur 2 som exempel på sådan variation. För återstoden av detta protokoll kommer T AG-härledda platser I och IV att representera subdominanta och immundominanta peptider, respektive. - Puls innehållet i varje märkt rör med 1 μM av respektive peptid för 1 h vid 37 ° c och 5% CO2.
- Använd en separat cellsil (med 70 μm porer) för varje tub för att ta bort klumpar och skräp om det behövs.
- Snurra röret på 400 x g i 5 min vid 4 ° c. Kassera supernatanten.
- Omsuspendera pelleterade celler i 12 mL sterilt kallt PBS och upprepa steg 4,4 en gång.
Obs: det är viktigt att ta bort så mycket FBS som möjligt eftersom FBS kan binda CFSE i nästa steg.
5. märkning mål splenocyter med CFSE
- Omsuspendera peptid-pulsade splenocyter i 4 mL steril PBS.
- Tillsätt CFSE vid 0,025 μM, 0,25 μM, och 2 μM in i rören som innehåller irrelevanta peptid-, plats I-och plats IV-pulsade splenocyter, respektive.
Anmärkning: för att uppnå enhetlig CFSE märkning, håll varje rör i en 45 ° vinkel innan du lägger CFSE till sidan något över cell SUS pensionen följs omedelbart av mild vortexing. Detta kommer att säkerställa uppkomsten av släta histogram i slutet. Parti-till-parti-och ålders beroende variationer i CFSE-intensiteter är inte ovanliga. Därför kan man behöva experimentera med differential CFSE doser innan man beslutar om optimala koncentrationer som skall användas.
Varning: CFSE är giftigt vid koncentrationer som är högre än 5 μM. - Placera rören inuti en 37 ° c inkubator för 15 min och Invertera dem en gång var 5 min.
- Tillsätt 3 mL Värmeinaktiverade FBS till varje tub för att stoppa CFSE-reaktionen. Upp innehållet med steril PBS.
- Snurra röret på 400 x g i 5 min vid 4 ° c. Kassera supernatanten.
- Omsuspendera pelleterade celler i 12 mL steril PBS och upprepa steg 5,5.
6. undersökning av adekvat/likvärdig CFSE-märkning av mål-Splenocytpopulationer
- Omsuspendera pelleterade celler i 3 mL PBS.
- Skaka rören varsamt. Överför 10 μL vardera av cfselåg, cfseIntermediate (int), och cfsehög cell SUS pensioner till en 5 ml rund botten polystyren Fluorescence-aktiverad cell sortering (facs) tub som innehåller 200 μl PBS.
- Förhöra celler med en flödescytometer utrustad med en 488 nm Laser. Rita en lymfocytgrind baserad på främre scatter (FSC) och Side scatter (SSC) egenskaper hos cellerna innan du förvärvar 5000 händelser som faller inom lymfocytporten i FL-1-kanalen.
- I den överordnade CFSE+ -populationen ritar du ytterligare histogram-portar för att identifiera cfseLow, CFSEintoch cfsehöga subpopulationer.
- Bekräfta lika eller nästan lika händelse nummer inom de tre portarna. Om det behövs justerar du cell numren i "käll rören" (steg 6,1) innan du blandar och injicerar målsplenocyter i naiva och primade möss i avsnitt 7.
7. injektion av CFSE-märkta mål celler till naiva och T-AG-primed mottagare
- Skaka försiktigt käll rören. Överför de tre CFSE-märkta cell SUS pensionerna i lika proportioner till ett nytt rör.
- Upp innehållet med steril PBS.
- Snurra röret på 400 x g i 5 min vid 4 ° c. Omsuspendera pelleterade celler med steril PBS.
- Räkna cellerna i trypan blå av en hemocytometern för att säkerställa cellulär livs kraft på minst 95%.
- Justera volymen för att injicera 1 x 107 blandade mål celler/200 μl PBS intravenöst (i.v.), via svans venen, i varje mottagare C57BL/6 mus.
Obs: Förvara cellerna på is mellan injektionerna. Blanda försiktigt mål cellerna före varje injektion. Spela in den exakta tidpunkten för injektion för varje mus, som kommer att avgöra när djuret kommer att behöva avlivas. Det är viktigt att hålla varaktigheten av in vivo cytotoxicitet konsekvent mellan alla djur i samma experiment.
8. data insamling
- Två eller fyra timmar efter injektionen av CFSE-märkta mål celler, euthanize mottagaren möss av cervikal disloksering.
Obs: varaktigheten av in vivo cytotoxicitet kan variera beroende på det experimentella systemet används, immunogeniciteten av mål AGS, det förväntade överflöd av peptid antigen-specifik TCD8 i mjälten, och robustheten av deras lytisk funktion bland andra faktorer. - Ta bort och behandla varje mjälte separat som i steg 3.2 − 3.9.
- Kassera supernatanten och omsuspendera pelleterade celler i 3 mL PBS.
Obs: var extra noga med att hantera mjältrör och cell preparat vid 4 ° c eller på is innan cytofluorimetriska analyser. Detta för att förhindra fortsatt cytotoxicitet ex vivo. - Överför cirka 1 x 107 celler från varje bearbetad mjälte till ett rent FACS-rör.
- Förhöra cellerna omedelbart med en flödescytometer utrustad med en 488-nm-Laser. Rita en lymfocytgrind baserad på FSC och SSC egenskaper av cellerna.
- Identifiera CFSE- mottagarens splenocyter och cfse+ överförda mål celler. Rita ytterligare portar med distinkta CFSElåg, cfseint, och cfsehög mål cell populationer.
- Förvärva totalt 2000 CFSElåga händelser i fl-1-kanalen.
9. analys av data
- Beräkna den specifika Lys av varje besläktat mål cell population med hjälp av följande formel:
% Specifik cytotoxicitet =
där x = cfseint/High händelse nummer i t AG-primed mus, y = cfselåg händelse nummer i t AG-primed mus, a = cfseint/hög händelse nummer i naiva mus och b = cfseLow händelse nummer i naiv mus.
Anmärkning: i "tre-topp" cytotoxicitetsanalyser där den specifika lysis av mer än en besläktat mål population utvärderas, är det inte lämpligt att använda mål cell frekvenser. Detta beror helt enkelt på att frekvensen av en besläktat mål cell population påverkas inte bara av den procentuella andelen av de irrelevanta kontrollerna, men också av den andra besläktat mål splenocyter. Därför bör händelse nummer inom varje grind användas i ovanstående formel för att exakt beräkna Lys av varje besläktat mål cell population (antingen cfseint eller cfsehöga celler) mot cfselåga kontroller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Målet med experimentet vars resultat avbildas i figur 1 var att avgöra om förekomst och funktioner av nTreg celler forma eller ändra immunodominans hierarkin av t AG-specifika tCD8. C57BL/6 möss injicerades i.p. med PBS eller med 0,5 mg av en anti-CD25 mAb (klon PC-61.5.3 [PC61]) fyra dagar innan de fick 2 x 107 C57SV tumör celler i.p. I separata experiment, en råtta IgG1 isotyp kontroll användes i stället för PBS. Framgångs rik nTreg cell utarmning av PC61 bekräftades genom flödescytometri17.
Nio dagar efter C57SV cell Inympning, en tidpunkt då T AG-specifika TCD8 svar når sin maximala23, varje djur fick en i.v. injektion av en cell SUS pension som innehåller 3 olika populationer av cfse-märkta mål celler. Kontroll mål cellerna var syngena naiva splenocyter samtidigt pulsad med två irrelevanta peptider (GP33-41 och GB498-505) och märkta med en låg dos av Cfse (0,02 μM). För att bereda de kognate mål cellerna var syngena naiva splenocyter pulsade med antingen T AG-härledd plats I peptid eller plats IV peptid (tabell 1), och därefter märkt med cfse vid 0,2 μm och 2 μm, respectively. Kontroll och besläktat mål celler tvättades och blandas i lika många (i en 1:1:1 ratio) innan de injicerades i naiva (kontroll) och T AG-primed C57BL/6 möss. Två timmar efter Målcell injektion, var möss offrades för sin mjälte där närvaron/frånvaron av CFSE-märkta mål celler bestämdes av flödescytometri. Mål cellerna utmärkte sig baserat på deras differentierade CFSE-färgintensiteter.
Som väntat, nästan lika toppar som motsvarar kontroll och besläktat mål celler var detekterbara hos naiva möss (figur 1, vänster panel). Däremot var mål cellerna på plats IV nästan helt frånvarande i T AG-primade möss oberoende av deras tidigare behandling med PC61 eller PBS (figur 1). Intressant, nTreg cell utarmning av PC61 förstärkt in vivo CTL-medierad lysis av plats I-pulsade mål celler17. Dessa resultat föranledde oss att dra satsen att nTreg celler selektivt hämmar plats I-specifik cytotoxicitet. Därför kan ntreg cell-nedbrytande/inaktiverande agenter förbättra den cytolytisk effektor funktion av CTL erkänner vissa tumör-derived epitopes.
Ovanstående set-up ger ett exempel på hur in vivo cytotoxicitetsanalyser kan användas för att samtidigt testa den lytiska funktionen av ID och SD CTL kloner i samma djur.
Figur 1: representativ cytofluorimetrisk analys av TCD8-medierad cytotoxicitet mot t AG-derived epitoper i närvaro eller avsaknad av nTreg-celler. Mål splenocyter pulsad med kontroll peptider, plats I eller plats IV, som var differentially märkt med CFSE, spårades av flödescytometri i mjälten av en naiv mus (vänster panel), en PBS-injiceras T AG-primed mus (Middle panel), och en PC61 (NTI-CD25)- injiceras (nTreg-utarmat) T AG-primade mus (höger panel). Procent specifikt dödande av mål celler beräknades med hjälp av formeln som beskrivs i protokollet, och representativa nummer visas. Denna siffra är antagen, med tillstånd, från Haeryfar et al.17. Copyright 2005. Den amerikanska föreningen för Immunologer, Inc. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
I en nyare undersökning, frågade vi om blockering PD-1 påverkar "bredden" av TCD8 svar på t AG16 (figur 2). Detta var en kliniskt relevant fråga mot bakgrund av de observerade terapeutiska fördelarna med PD-1-baserade "Checkpoint-hämmare" i flera maligniteter. Även om sådana hämmare tros fungera främst genom att vända T cell utmattning, vi var nyfikna att veta om att störa PD-1-PD-L1 interaktioner kan dessutom bredda (eller smala) mot cancer TCD8 svar. I vår T AG erkännande modell, intracellulär cytokin färgning (ICS) experiment visade att behandling med antingen anti-PD-1 eller anti-PD-L-1 selektivt expanderar IFN-γ-producerande TCD8 erkänna platser I och II/III16. Vi förlängde sedan vår studie för att undersöka in vivo cytolytisk effektor funktion av dessa SD CTL. C57BL/6 möss injicerades i.p. med 100 μg av en anti-PD-1 mAb (klon RMP1-14) eller en råtta IgG2a isotypen kontroll (klon 2a3) två timmar före C57SV cellinympning. Möss fick två ytterligare doser av anti-PD-1 eller isotyp tre och sex dagar efter tumör cell injektion. På dag 9 efter priming, kohorter av naiva och grundmålas möss gavs via laterala svans vener, en cell blandning som innehåller lika många CFSElåg (cfse märknings dos: 0,025 μm), cfseint (cfse märknings DOS: 0,25 ΜM), och cfseHi (cfse märknings DOS: 2 μM) syngena naiva splenocyter pulsade med gB498-505, plats II/III, respektive plats I. Fyra timmar senare, djur var euthanized, och CFSE-märkta mål celler spårades cytofluorimetriskt i sin mjälte. Representativa FACS-diagram (figur 2A) och data från 3 djur per kohort (figur 2b) illustreras. Medan PD-1 blockad inte påverkade ID TCD8 svar mot plats IV16, platser I-och II/III-specifika SD svar var stärkta. Vi drog därför satsen att störa PD-1-PD-L1 interaktioner kan inducera epitop spridning i cancer TCD8 svar.
Ovanstående uppsättning representerar in vivo dödande analyser som möjliggör kvantitation av cytotoxicitet som framkallas av två SD CTL-kloner i samma djur.
Figur 2: in vivo cytotoxicitet av T AG-specifik TCD8 hos anti-PD-1-behandlade möss. Arepresentativa histogramdiagram visar de cfse-toppar som motsvarar mål splenocyter pulsad med en irrelevant peptid (cfseLow), plats II/III (cfseint) och plats i (cfsehög) i T AG-primade möss som fick en isotyp (vänster panel) eller en PD-1-blockerande mAb (höger panel). (B) procent specifikt dödande av varje kognat mål cell population beräknades med hjälp av cfse+ händelse nummer i T AG-primed möss (n = 3 per grupp) och naiva mottagare (visas inte) och formeln som beskrivs i protokollet. Felstaplar representerar standard fel i medelvärdet (SEM), och * * betecknar en statistisk skillnad med p < 0,01 med oparade Students t-test. Denna siffra är antagen, med tillstånd, från Memarnejadian et al.16. Copyright 2017. Den amerikanska föreningen för Immunologer, Inc. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Protein antigen källa | Peptid Epitope | Beteckningen | Sekvens | MHC I begränsning |
| SV401 stor T AG2 | T AG206-215 | Webbplats I | Mer från SAINNYAQKL | H-2Db |
| SV40 stora T AG | T AG223-231 | Plats II/III | Mer från CKGVNKEYL | H-2Db |
| SV40 stora T AG | T AG404-411 | Plats IV | Mer från VVYDFLKC | H-2Kb |
| SV40 stora T AG | T AG489-497 | Webbplats V | Mer från QGINNLDNL | H-2Db |
| HSV-13 glykoprotein B | gB498-505* | gB498-505 | Mer från SSIEFARL | H-2Kb |
| LCMV4 glykoprotein | GP33-41* | GP33-41 | Mer från KAVYNFATC | H-2Db |
| 1 den första Simian virus 40 | ||||
| 2 för att Stora tumör antigen | ||||
| 3 för att Herpes simplex virus typ 1 | ||||
| 4 för att Lymfocytisk Koriomeningitis virus | ||||
| * används som en irrelevant peptid | ||||
I tabell 1. Peptider som införs i detta protokoll
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CFSE-baserade in vivo cytotoxicitet analyser erbjuder flera fördelar jämfört med traditionella dödande analyser såsom radioaktivt krom (51CR) Release och kolorimetrisk laktatdehydrogenas (LDH) frisättning analyser. Först, de tillåter övervakning av CTL-funktionen inom en arkitektoniskt intakt sekundära lymfoida organ.
För det andra, det specifika dödandet av mål celler i in vivo cytotoxicitet analyser återspeglar det absoluta antalet AG-specifika TCD8, som vanligt vis, men inte alltid, en funktion av TCD8 frekvenser som finns i mjälte. Detta är i motsats till 51CR/LDH release analyser där ett konstant antal celler är anställda som en källa till effektor TCD8. Följaktligen, 51CR/LDH release analyser Miss lyckas med att tillförlitligt uppskatta det totala antalet AG-specifika TCD8 som kan vara tillgängliga för värden för att eliminera tumör celler eller för att bekämpa infektioner. Detta är viktigt eftersom i många fall och villkor, storlek och cellularitet av sekundära lymfoida organ/vävnader som rymmer AG-specifika TCD8 ändras. Till exempel kan ett hypotetiskt scenario planeras där en virus infektion höjer det totala antalet TCD8 specifik för peptid X medan också expanderande flera andra tCD8 kloner hyser andra särdrag. Som ett resultat, frekvensen av X-specifik TCD8 bland totalt mjälten tCD8 kan inte öka, i vilket fall en 51CR/LDH release-analysen kommer inte att vara till hjälp. Som ett annat exempel, vi nyligen visat att vissa bakteriella superantigener expandera minne TCD8 specifik för NP147-155, en immundominerande peptid epitop av influensa A-virus i Balb/c möss, som korrelerade väl med ökad in vivo lysis av NP147-155-pulsade mål celler31. Eftersom exponering för superantigener provocerar T-cellsproliferation icke-specifikt, skulle det ha varit högst osannolikt att uppvisa betydande NP147-155-specifik cytotoxicitet med 51CR/LDH release-analyser.
För det tredje, mål celler pulsade med peptider som binder till samma MHC klass I molekyl kan märkas med olika doser av CFSE, blandat och används i in vivo cytotoxicitet analyser. Samtidig analys av CTL-funktioner mot sådana peptider är inte ett alternativ i 51CR/LDH release-analyser.
Fjärde, in vivo cytotoxicitet analyser tillåter mekanistiska studier under priming, effektor och återkalla faser av CTL svar. Till exempel, tumör cell inympning eller antitumöreffekt vaccination kan genomföras i genetiskt förändrade möss för bedömning av CTL induktion. Dessutom kan splenocyter från gen knock-in och knock-out möss användas som mål celler under effektor fasen. Slutligen, olika agenter (t. ex. farmakologiska hämmare och läkemedels kandidater) kan administreras innan priming, under effektor fas, eller båda. Därför ger in vivo cytotoxicitet analyser en kraftfull plattform för läkemedels-/vaccin effekt test i en verkligt in vivo-inställning. I denna mängd arbete har vi tillhandahållit exempel på immunologiska interventioner som ökar in vivo CTL-svar (figur 1 och figur 2).
Liksom andra rutinmässigt använda avlivnings försök ger in vivo-analyser av cytotoxicitet inte någon direkt information om CTLs förmåga att återvinna från ett mål till ett annat innan de blir uttömda. Dessutom har vi testat flera tumör cell typer som potentiella mål celler i in vivo cytotoxicitetsanalyser, om än till ingen nytta hittills. Detta är helt enkelt eftersom tumör celler inte når mjälten åtminstone i detekterbara siffror efter att de injiceras i.v. Därför, förlitar sig på mus splenocyter som mål celler kan betraktas som en inneboende begränsning av in vivo cytotoxicitet analyser. Det är anmärknings värt, dock, att adoptivt överförda mål splenocyter lätt kan hittas i flera andra organ (utöver mjälte), till exempel i levern. Därför kan AG-specifika CTL-funktionen bedömas i flera organ eller vävnader.
Vi har optimerat in vivo cytotoxicitetsanalyser för undersökning av immunodominans i t AG-specifika tCD8 -svar16,17. Många verktyg och reagenser finns för att studera dessa svar i sammanhang av antitumöreffekt immunitet och terapi. Fibrosarkom cellinjen som används i det protokoll som beskrivs här (dvs. C57SV-celler) ger inte upphov till tumörer hos immunkompetenta möss. Därför är det ett användbart verktyg för att utreda antitumöreffekt vaccination. T AG-driven neoplastisk omvandling i utvalda vävnader har genererat flera värdefulla modeller av autokton cancer. Till exempel, SV11 möss som utvecklar plexus koroidea papillom inuti sina hjärn ventriklar35 inte hysa endogena t AG-specifika tCD8 eftersom dessa celler väljs mot och raderas i brässen. Men, överföra C57BL/6 splenocyter i sublethally bestrålade, tumör-bärande SV11 möss leder till utökad kontroll av tumörer, som enligt uppgift för knippas med in vivo priming av plats IV-specifika TCD836,37 . I den transgena adenocarcinom i mus prostata (TRAMP) modell38, plats IV-specifikt svar krympt med progression av malignitet. Emellertid, den annars immunorecessiv plats V-specifika TCD8 celler undkomma negativa val i Thymus och även undvika perifer tolerans mekanismer21. Detta ger gott om möjligheter för experimentella terapeutiska interventioner kretsar kring plats V-specifika TCD8 funktioner. In vivo bör cytotoxicitetsanalyser Visa sig informativa i studier och potentiellt reverserande immunologisk tolerans i olika modell system, bland annat i T AG-igenkännings modellen.
Immunodominans är ett konsekvent inslag i TCD8 svar genereras inte bara mot tumör AGS men också mot patogen-derived epitopes. I själva verket har vi tidigare använt in vivo cytotoxicitet analyser för att studera immunodominans i anti-influensa TCD8 svar12. Därför kan den optimerade analysen som beskrivs i detta protokoll modifieras och användas i ett brett spektrum av immunologiska tillämpningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av kanadensiska institut för hälso forskning (CIHR) beviljar MOP-130465 och PJT-156295 till SMMH. JC är delvis stöds av en drottning Elizabeth II Graduate stipendium i vetenskap och teknik från Ontario ministeriet för utbildning, hög skolor och universitet. CEM var mottagare av en Alexander Graham Bell Canada Graduate stipendium (doktors examen) från naturvetenskap och teknik forsknings rådet i Kanada (NSERC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Thermo Fisher Scientific | 25200-056 | |
| ACK Lysing Buffer | Thermo Fisher Scientific | A1049201 | |
| Anti-mouse CD25 (clone PC-61.5.3) | Bio X Cell | BE0012 | |
| Anti-mouse PD-1 (clone RMP1-14) | Bio X Cell | BE0146 | |
| CFSE | Thermo Fisher Scientific | C34554 | |
| DMEM (1X) | Thermo Fisher Scientific | 11965-092 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Wisent Bioproducts | 080-150 | Heat-inactivate prior to use |
| GlutaMAX (100X) | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| HEPES (1M) | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | 10 mM final concentration |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | Stock is 100X |
| Rat IgG1 (clone KLH/G1-2-2) | SouthernBiotech | 0116-01 | Isotype control |
| Rat IgG1 (clone HRPN) | Bio X Cell | BE0088 | Isotype control |
| Rat IgG1 (clone TNP6A7) | Bio X Cell | BP0290 | Isotype control |
| Rat IgG2a (clone 2A3) | Bio X Cell | BP0089 | Isotype control |
| RPMI 1640 (1X) | Thermo Fisher Scientific | 11875-093 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | 1 mM final concentration |
References
- Yewdell, J. W., Bennink, J. R. Immunodominance in major histocompatibility complex class I-restricted T lymphocyte responses. Annual Review of Immunology. 17, 51-88 (1999).
- Chen, W., et al. Reversal in the immunodominance hierarchy in secondary CD8+ T cell responses to influenza A virus: roles for cross-presentation and lysis-independent immunodomination. The Journal of Immunology. 173 (8), 5021-5027 (2004).
- Otahal, P., et al. Inefficient cross-presentation limits the CD8+ T cell response to a subdominant tumor antigen epitope. The Journal of Immunology. 175 (2), 700-712 (2005).
- Lauron, E. J., et al. Cross-priming induces immunodomination in the presence of viral MHC class I inhibition. PLoS Pathogens. 14 (2), e1006883 (2018).
- Crowe, S. R., et al. Differential antigen presentation regulates the changing patterns of CD8+ T cell immunodominance in primary and secondary influenza virus infections. The Journal of Experimental Medicine. 198 (3), 399-410 (2003).
- Probst, H. C., et al. Immunodominance of an antiviral cytotoxic T cell response is shaped by the kinetics of viral protein expression. The Journal of Immunology. 171 (10), 5415-5422 (2003).
- Gileadi, U., et al. Generation of an immunodominant CTL epitope is affected by proteasome subunit composition and stability of the antigenic protein. The Journal of Immunology. 163 (11), 6045-6052 (1999).
- Zanker, D., Waithman, J., Yewdell, J. W., Chen, W. Mixed proteasomes function to increase viral peptide diversity and broaden antiviral CD8+ T cell responses. The Journal of Immunology. 191 (1), 52-59 (2013).
- Deng, Y., Yewdell, J. W., Eisenlohr, L. C., Bennink, J. R. MHC affinity, peptide liberation, T cell repertoire, and immunodominance all contribute to the paucity of MHC class I-restricted peptides recognized by antiviral CTL. The Journal of Immunology. 158 (4), 1507-1515 (1997).
- Chen, W., Khilko, S., Fecondo, J., Margulies, D. H., McCluskey, J. Determinant selection of major histocompatibility complex class I-restricted antigenic peptides is explained by class I-peptide affinity and is strongly influenced by nondominant anchor residues. The Journal of Experimental Medicine. 180 (4), 1471-1483 (1994).
- Kotturi, M. F., et al. Naive precursor frequencies and MHC binding rather than the degree of epitope diversity shape CD8+ T cell immunodominance. The Journal of Immunology. 181 (3), 2124-2133 (2008).
- Haeryfar, S. M., et al. Terminal deoxynucleotidyl transferase establishes and broadens antiviral CD8+ T cell immunodominance hierarchies. The Journal of Immunology. 181 (1), 649-659 (2008).
- Leon-Ponte, M., Kasprzyski, T., Mannik, L. A., Haeryfar, S. M. Altered immunodominance hierarchies of influenza A virus-specific H-2(b)-restricted CD8+ T cells in the absence of terminal deoxynucleotidyl transferase. Immunological Investigations. 37 (7), 714-725 (2008).
- Kedl, R. M., et al. T cells compete for access to antigen-bearing antigen-presenting cells. The Journal of Experimental Medicine. 192 (8), 1105-1113 (2000).
- Kastenmuller, W., et al. Cross-competition of CD8+ T cells shapes the immunodominance hierarchy during boost vaccination. The Journal of Experimental Medicine. 204 (9), 2187-2198 (2007).
- Memarnejadian, A., et al. PD-1 Blockade Promotes Epitope Spreading in Anticancer CD8(+) T Cell Responses by Preventing Fratricidal Death of Subdominant Clones To Relieve Immunodomination. The Journal of Immunology. 199 (9), 3348-3359 (2017).
- Haeryfar, S. M., DiPaolo, R. J., Tscharke, D. C., Bennink, J. R., Yewdell, J. W. Regulatory T cells suppress CD8+ T cell responses induced by direct priming and cross-priming and moderate immunodominance disparities. The Journal of Immunology. 174 (6), 3344-3351 (2005).
- Rytelewski, M., et al. Suppression of immunodominant antitumor and antiviral CD8+ T cell responses by indoleamine 2,3-dioxygenase. PLoS One. 9 (2), e90439 (2014).
- Maleki Vareki, S., et al. Differential regulation of simultaneous antitumor and alloreactive CD8(+) T-cell responses in the same host by rapamycin. American Journal of Transplantation. 12 (1), 233-239 (2012).
- Irvine, K., Bennink, J. Factors influencing immunodominance hierarchies in TCD8+ -mediated antiviral responses. Expert Review of Clinical Immunology. 2 (1), 135-147 (2006).
- Grossmann, M. E., Davila, T., Celis, T. Avoiding tolerance against prostatic antigens with subdominant peptide epitopes. Journal of Immunotherapy. 24 (3), 237-241 (2001).
- Schreiber, H., Wu, T. H., Nachman, J., Kast, W. M.
- Mylin, L. M., et al. Quantitation of CD8(+) T-lymphocyte responses to multiple epitopes from simian virus 40 (SV40) large T antigen in C57BL/6 mice immunized with SV40, SV40 T-antigen-transformed cells, or vaccinia virus recombinants expressing full-length T antigen or epitope minigenes. Journal of Virology. 74 (15), 6922-6934 (2000).
- Fu, T. M., et al. An endoplasmic reticulum-targeting signal sequence enhances the immunogenicity of an immunorecessive simian virus 40 large T antigen cytotoxic T-lymphocyte epitope. Journal of Virology. 72 (2), 1469-1481 (1998).
- Chen, W., et al. Cross-priming of CD8+ T cells by viral and tumor antigens is a robust phenomenon. European Journal of Immunology. 34 (1), 194-199 (2004).
- Memarnejadian, A., Meilleur, C. E., Mazzuca, D. M., Welch, I. D., Haeryfar, S. M. Quantification of Alloantibody-Mediated Cytotoxicity In Vivo. Transplantation. 100 (5), 1041-1051 (2016).
- Aichele, P., et al. Peptide antigen treatment of naive and virus-immune mice: antigen-specific tolerance versus immunopathology. Immunity. 6 (5), 519-529 (1997).
- Oehen, S., Brduscha-Riem, K. Differentiation of naive CTL to effector and memory CTL: correlation of effector function with phenotype and cell division. The Journal of Immunology. 161 (10), 5338-5346 (1998).
- Coles, R. M., Mueller, S. N., Heath, W. R., Carbone, F. R., Brooks, A. G. Progression of armed CTL from draining lymph node to spleen shortly after localized infection with herpes simplex virus 1. The Journal of Immunology. 168 (2), 834-838 (2002).
- Barber, D. L., Wherry, E. J., Ahmed, R. Cutting edge: rapid in vivo killing by memory CD8 T cells. The Journal of Immunology. 171 (1), 27-31 (2003).
- Meilleur, C. E., et al. Bacterial superantigens expand and activate, rather than delete or incapacitate, preexisting antigen-specific memory CD8+ T cells. The Journal of Infectious Diseases. , Epub ahead of print (2018).
- Goldszmid, R. S., et al. Dendritic cells charged with apoptotic tumor cells induce long-lived protective CD4+ and CD8+ T cell immunity against B16 melanoma. The Journal of Immunology. 171 (11), 5940-5947 (2003).
- Oberg, L., et al. Loss or mismatch of MHC class I is sufficient to trigger NK cell-mediated rejection of resting lymphocytes in vivo - role of KARAP/DAP12-dependent and -independent pathways. European Journal of Immunology. 34 (6), 1646-1653 (2004).
- Wingender, G., Krebs, P., Beutler, B., Kronenberg, M. Antigen-specific cytotoxicity by invariant NKT cells in vivo is CD95/CD178-dependent and is correlated with antigenic potency. The Journal of Immunology. 185 (5), 2721-2729 (2010).
- Brinster, R. L., et al. Transgenic mice harboring SV40 T-antigen genes develop characteristic brain tumors. Cell. 37 (2), 367-379 (1984).
- Tatum, A. M., et al. CD8+ T cells targeting a single immunodominant epitope are sufficient for elimination of established SV40 T antigen-induced brain tumors. The Journal of Immunology. 181 (6), 4406-4417 (2008).
- Schell, T. D., Tevethia, S. S. Control of advanced choroid plexus tumors in SV40 T antigen transgenic mice following priming of donor CD8(+) T lymphocytes by the endogenous tumor antigen. The Journal of Immunology. 167 (12), 6947-6956 (2001).
- Greenberg, N. M., et al. Prostate cancer in a transgenic mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (8), 3439-3443 (1995).
