שיטות לבדיקת הפרעה אנדוקרינית בדרוזופילה מלאנוסטר

Summary

המערכת האנדוקרינית (EDCs) מייצגת בעיה רצינית עבור אורגניזמים ובסביבות טבעיות. דרוזופילה מלאנוסטר מייצגת מודל אידיאלי לחקר אפקטי edc בvivo. כאן אנו מציגים שיטות לחקירת שיבוש המערכת האנדוקרינית בדרוזוהילה, לטיפול באפקטי EDC על פוריות, פוריות, תזמון התפתחותי ותוחלת חיים של הזבוב.

Abstract

בשנים האחרונות הוכחה גוברת כי כל האורגניזמים והסביבה חשופים לכימיקלים כמו הורמונים, המכונה המערכת האנדוקרינית כימיקלים (EDCs). כימיקלים אלה עשויים לשנות את האיזון הרגיל של מערכות אנדוקריניות להוביל לתופעות לוואי, כמו גם מספר גדל והולך של הפרעות הורמונליות באוכלוסייה האנושית או צמיחה מופרעת ורבייה מופחתת במינים חיות הבר. עבור חלק מ-EDCs, קיימים השפעות בריאותיות מתועדות והגבלות על השימוש בהם. עם זאת, עבור רובם, עדיין אין ראיות מדעיות במובן הזה. כדי לאמת את ההשפעות האנדוקריניות הפוטנציאליות של כימיקל באורגניזם המלא, אנו צריכים לבדוק אותו במערכות מודל מתאימות, כמו גם בזבוב הפירות, דרוזופילה מלאנוגסטר. כאן אנו מדווחים מפורט בפרוטוקולים vivo כדי לחקור את ההפרעה האנדוקרינית בדרוזוהילה, מטפל בהשפעות EDC על פוריות/פוריות, התפתחות העיתוי, ותוחלת החיים של הזבוב. בשנים האחרונות, השתמשנו בתכונות אלה החיים הדרוזובית כדי לחקור את ההשפעות של חשיפה 17-α-ethinyלסטרנול (EE2), ביאגנול A (BPA), ו ביאגנול AF (BPA F). בסך הכל, אלה האומרים מכוסים כל החיים Drosophila ילה והפכה את האפשרות להעריך את ההפרעה האנדוקרינית בכל תהליכי הורמון בתיווך. פוריות/פריון והתפתחות עיתוי התפתחותי היו שימושיים למדוד את השפעת ה-EDC על ביצועי הרבייה לטוס ועל שלבים התפתחותיים, בהתאמה. בסופו של דבר, שיטת תוחלת החיים מעורבת בחשיפות EDC כרוניות למבוגרים ומדדו את ההישרדות שלהם. עם זאת, תכונות חיים אלה יכולים גם להיות מושפעים על ידי כמה גורמים ניסיוניים כי צריך להיות נשלט בקפידה. לכן, בעבודה זו, אנו מציעים סדרה של הליכים שאנו ממוטבים עבור התוצאה הנכונה של אלה מספר. שיטות אלה מאפשרות למדענים להקים שיבוש אנדוקריניות עבור כל EDC או לתערובת של מחשבי ה-Edc שונים בדרוזוהילה, למרות שכדי לזהות את המנגנון האנדוקרינית האחראי לאפקט, ניתן יהיה לדרוש חיבורים נוספים.

Introduction

פעילויות אנושיות משחררים לסביבה כמות עצומה של כימיקלים, המייצגים בעיה רצינית לאורגניזמים ולמערכת אקולוגית טבעית¹. מזהמים אלה, מעריכים כי על 1,000 כימיקלים שונים עשויים לשנות את האיזון הרגיל של מערכות אנדוקריניות; לפי תכונה זו, הם מסווגים כימיקלים המערכת האנדוקרינית משבש (EDCs). באופן ספציפי, מבוסס על הגדרה לאחרונה על ידי החברה האנדוקרינית, EDCs הם “כימיקל אקסוגני, או תערובת של כימיקלים, כי יכול להפריע לכל היבט של פעולה הורמונלית”². בשלושת העשורים האחרונים, יש כבר גידול ראיות מדעיות כי edcs יכול להשפיע על רבייה ופיתוח של בעלי חיים וצמחים^3,4,5,6,7, ^שמונה. יתר על כן, חשיפה edc היתה קשורה השכיחות הגוברת של כמה מחלות האדם, כולל סרטן, השמנת יתר, סוכרת, מחלות בלוטת התריס, הפרעות התנהגותיות^9,10,11.

מנגנונים כלליים של EDC

עקב התכונות המולקולריות שלהם, edcs להתנהג כמו הורמונים או הורמונים מקדים^3,4,5,6,7,^{8,9, . עשר,11,12} במובן זה, הם יכולים לאגד קולטן הורמון לשבש מערכות אנדוקריניות או על ידי מחקה פעילות הורמון או על ידי חסימת הורמונים אנדוגניים מחייב. במקרה הראשון, לאחר הכריכה לקולטן, הם יכולים להפעיל אותו כמו הורמון הטבעי שלו יעשה. במקרה השני, קשירה של ה-EDC לקולטן מונע את הכריכה של הורמון הטבעי שלה, כך הקולטן חסומה ולא ניתן עוד להפעיל, אפילו בנוכחות הורמון טבעי³. כתוצאה מכך, EDCs יכול להשפיע על מספר תהליכים, כגון סינתזה, הפרשה, תחבורה, חילוף החומרים, או פעולה היקפית של הורמונים אנדוגניים האחראים לתחזוקת הומאוסטזיס, רבייה, פיתוח, ו/או התנהגות של האורגניזם כריכת הקולטן אינה הדרך היחידה לפעולה המתוארת עד כה ל-EDCs. כעת ברור כי הם יכולים גם לפעול על ידי גיוס מפעילים או corepressors ב מסלולים אנזימטיים או על ידי שינוי סמנים אפיגנטיים להסיר ביטוי גנים^{10,11,12,13 ,14}, עם השלכות לא רק עבור הדור הנוכחי אלא גם עבור בריאות של דורות לבוא⁸.

הורמוני דרוזופילה

ההשפעות הפוטנציאליות של ה-EDCs שנבחרו נחקרו רבות, הן במינים של חיות הבר והן במערכות מודל מסוימות בהן מנגנונים אנדוקריניים ידועים באופן סביר. עבור חסרי חוליות, מערכות אנדוקריניות המשפיעות על הצמיחה, הפיתוח והרבייה האופיינים בהרחבה בחרקים מכמה סיבות, תוך שימוש נרחב בתחום המחקר הביולוגי, החשיבות הכלכלית שלהם ו לבסוף התפתחות של קוטלי חרקים המסוגלים להתערב במיוחד במערכת ההורמונים של חרקים מזיקים.

במיוחד, בין חרקים, זבוב הפירות D. melanogaster הוכיחה להיות מערכת מודל רבת עוצמה כדי להעריך את ההשפעות האנדוקריניות הפוטנציאליות של edcs. ב D. melanogaster, כמו גם בעלי חוליות, הורמונים לשחק תפקיד חשוב לאורך כל מחזור החיים. באורגניזם זה, יש שלוש מערכות הורמונליות הראשי, אשר כרוכות הורמון הסטרואידים 20-hydroxyecdysone (20e)^15,16, הורמון הקטין לנוער sesquאיטראיד (jh)¹⁷, ואת נוירופפטידים ו פפטיד/חלבון הורמונים¹⁸. קבוצה שלישית זו מורכבת ממספר פפטידים שהתגלו לאחרונה אך בבירור מעורבים במגוון עצום של תהליכים פיזיולוגיים והתנהגותיים, כגון אריכות ימים, הומאוסטזיס, חילוף החומרים, רבייה, זיכרון, ו locomotor control. 20E הוא הומוולוגי להורמונים סטרואידים נגזרים כולסטרול כגון estradiol, בעוד JH שותפים כמה קווי דמיון עם חומצה retinoic; שניהם הורמונים ידועים יותר. בדרוזוהילה^19,20 האיזון שלהם חיוני בתיאום המולטינג והגלגול, כמו גם בשליטה על מספר תהליכים פוסט-התפתחותיים, כגון רבייה, תוחלת חיים, והתנהגות²¹, ובכך מציעה אפשרויות שונות לבדיקה אנדוקרינית הפרעה בדרוזופילה. יתרה מזאת, הורמונים ecdysteroid ו-JHs הם המטרות העיקריות של האינסקטיצידים הדור השלישי, שפותחו כדי להפריע לתהליכים התפתחותיים והרבייה בתיווך בחרקים. הסוג האגוניסט או מצב היריב של הכימיקלים האלה ידוע היטב, ולכן הם יכולים לשמש כסטנדרטים להתייחסות להערכת ההשפעות של מחשבי ה-EDCs הפוטנציאליים על הצמיחה, הרבייה והפיתוח של חרקים²². לדוגמה, מתיונין, אשר כבר בשימוש נרחב בשליטה יתושים וחרקים מימיים אחרים^23,24, עובד כמו אגוניסט jh ו לוחץ מחדש 20e המושרה שעתוק ומטמורפוזה.

בנוסף להורמונים הורמונים, הקולטן הגרעינית (NR) בדרוסופילה ידועה גם כן; הוא מורכב מ -18 מקדמי שימור ושימור שימור הקשורים במסלולים התפתחותיים תלויי הורמונים, כמו גם רבייה ופיזיולוגיה²⁵. הורמון זה NRs שייך לכל ששת מיני-משפחה של ה-NR, כולל אלה מעורבים נוירותמסורת²⁶, שניים עבור חומצה Retinoic nrs, אלה עבור סטרואידים nrs כי, בעלי חוליות, מייצגים אחד היעדים העיקריים של edcs²⁷.

דרוסופילה כמערכת מודל לחקר הפקולטה למדעי המחשב

כיום, על בסיס של תכונות מולקולריות, מספר סוכנויות סביבתיות ברחבי העולם מייחס את הפוטנציאל להפריע למערכות האנדוקריניות לכימיקלים שונים מעשה ידי אדם. בהינתן כי EDCs הם בעיה גלובלית בכל מקום עבור הסביבה ועבור אורגניזמים, המטרה הכוללת של המחקר בתחום זה היא להפחית את נטל המחלה שלהם, כמו גם כדי להגן על אורגניזמים חיים מהשפעות שליליות שלהם. על מנת להעמיק את ההבנה על ההשפעות האנדוקריניות הפוטנציאליות של כימיקל, יש צורך לבחון אותו בvivo. למטרה זו, ד. מלאנוגסטר מייצג מערכת מודל תקפה. עד היום, זבוב הפירות היה בשימוש נרחב כמו במודל vivo כדי להעריך את ההשפעות של מספר EDCs סביבתיים; דווח כי חשיפה לכמה edcs, כגון דיבוטיל פתלאט (dbp)²⁸, בינתנול A (BPA), 4-nonylphenol (4-NP), 4-tert-octylphenol (4-tert-OP)²⁹, מתיל paraben (MP)³⁰, ethylparen (EP)^{31, 32}, bis-(2-ethylyl) פתלאט (dehp)³³, ו-17-α-ethinyלסטרנול (EE2)³⁴, משפיע על חילוף החומרים ופונקציות אנדוקריניות כמו במודלים בעלי חוליות. מספר סיבות הובילו לשימוש בו כמודל בתחום זה של המחקר. מעבר לידע מצוין של המערכות האנדוקריניות שלה, יתרונות נוספים כוללים את מחזור החיים הקצר שלה, עלות נמוכה, בקלות manipulable הגנום, היסטוריה ארוכה של מחקר, ומספר אפשרויות טכניות (לראות את האתר FlyBase, http://flybase.org/). ד. melanogaster מספק גם מודל רב עוצמה לחקר בקלות השפעות טרנסדוריים ותגובות האוכלוסייה לגורמים סביבתיים⁸ ונמנע בעיות אתיות הרלוונטיות למחקרים vivo בבעלי חיים גבוהים יותר. בנוסף, זבוב הפירות משתף מידה גבוהה של שימור גנים עם בני אדם שעשויים לאפשר לדרוזוהילה edc בחני לסייע בחיזוי או בהצעת השפעות פוטנציאליות של כימיקלים אלה לבריאות האדם. מלבד הרחבת ההבנה על השפעות בריאותיות של האדם, דרוזופילה יכול לעזור להעריך את הסיכונים של חשיפת EDC לסביבה, כגון אובדן מגוון המינים והשפלה סביבתית. לבסוף, זבוב הפירות מציע את היתרון הנוסף של השימוש במעבדות, שבו הגורמים העלולים להשפיע על התפתחותו, הרבייה ותוחלת החיים ניתן לשמור תחת שליטה על מנת לייחס כל וריאציה על החומר להיבדק.

עם זאת בראש, יש לנו אופטימיזציה כושר פשוטה ואיתנה לקביעת אפקטים של EDC על כמה מאפיינים הורמונליים של דרוזוהילה, כגון פוריות/פוריות, עיתוי התפתחותי, ותוחלת חיים של מבוגרים. מספר זה שימשו באופן נרחב לכמה מהנגמ ש^{23,24,25,26,27}. בפרט, השתמשנו בפרוטוקולים הבאים כדי להעריך את ההשפעות של החשיפה לאסטרוגן סינתטי EE2³⁴ ו BPA ו ביפרונול AF (BPA F) (נתונים שלא פורסמו). פרוטוקולים אלה עשויים להיות שונה בקלות כדי לחקור את ההשפעות של EDC נתון בכל פעם, כמו גם את ההשפעות המשולבות של מספר Edc ב D. melanogaster.

Protocol

1. הכנת מזון לתחזוקת מניות ולגידול זחל, השתמש במדיום ארוחה בינונית המכילה 3% אבקת שמרים, 10% סוכרוז, 9% קמח תירס מבושל מראש, 0.4% אגר, לאחר מכן המכונה בינונית קמח תירס (CM). לשים 30 גרם של שמרים לתוך 100 mL של מי ברז, להביא אותו לרתיחה ולתת לו לרתוח עבור 15 דקות. בנפרד, מערבבים היט?…

Representative Results

בסעיף זה, מדווחים שלבי המפתח של הפרוטוקולים הנ ל בצורה של סכימות פשוטות יותר. בהינתן כי זבובים נוטים להימנע תרכובות טעים, הדבר הראשון לעשות הוא לקבוע את הטעם של EDC נבחר. זה יכול להיעשות על ידי ערבוב של צביעה מזון (למשל, צבע אדום מאכל no. 40)35 עם המזון שיושלם עם edc נבחר במינונים שונים …

Discussion

זבוב הפירות D. melanogaster היה מועסק בהרחבה כמו במערכת vivo model כדי לחקור את ההשפעות הפוטנציאליות של הסביבה edcs כגון dbp²⁸, BPA, 4-NP, 4-tert-OP²⁹, MP³⁰, EP^{31, 32}, dehp³³, ו EE2³⁴. מספר סיבות הובילו את השימוש בו כמודל בתחום…

Materials

17α-Ethinylestradiol	Sigma	E4876-1G
Agar for Drosophila medium	BIOSIGMA	789148
Bisphenol A	Sigma	239658-50G
Bisphenol AF	Sigma	90477-100MG
Cornmeal	CA' BIANCA
Diethyl ether	Sigma
Drosophila Vials	BIOSIGMA	789008	25×95 mm
Drosophila Vials	BIOSIGMA	789009	29×95 mm
Drosophila Vials	Kaltek	187	22X63
Embryo collection cage	Crafts		Plexiglass cylinder (12,5 x7 cm) with an open end and the other end closed by a rectangular base in which a slot allows the insertion of special trays for laying
Ethanol	FLUKA	2860
Etherizer	Crafts		cylindrical glass container with a cotton plug
Glass Bottle			250mL Bottles
Glass Vials	Microtech	ST 10024	FLAT BOTTOM TUBE 100X24
Hand blender Pimmy	Ariete		food processor
Instant Success yeast	ESKA		Powdered yeast
Laying tray	Crafts		plexiglass trays (11 x 2,6 cm) in wich to pour medium for laying
Methyl4-hydroxybenzoate	SIGMA	H5501
Petri Dish	Falcon	351016	60×5
Red dye no. 40	SIGMA	16035
Stereomicroscope with LED lights	Leica		S4E
Sucrose	HIMEDIA	MB025
Tomato sauce	Cirio