腫瘍の微小環境は、がんの成長と侵攻の不可欠な部分です。癌腫の進行を模倣するためには、生物学的に関連したヒトマトリックスが必要である。このプロトコルは、ヒト平滑筋腫ベースのマトリックスを適用することによって in vitro 三次元スフェロイドの侵襲アッセイの改善を導入する。このプロトコルは、コンピュータベースの細胞浸潤解析も導入している。
二次元細胞培養ベースのアッセイは、体外癌研究において一般的に使用されています。しかし、それらは、腫瘍微小環境を形成するいくつかの基本的な要素を欠いている。より信頼性の高いインビトロ結果を得るために、いくつかの三次元 (3D) 細胞培養アッセイが導入されている。これらのアッセイは、癌細胞が細胞外マトリックスと相互作用することを可能にする。この相互作用は、細胞の形態と同様に、増殖および浸潤などの細胞の挙動に影響を与えます。さらに、この相互作用は、いくつかのプロおよび抗腫瘍化分子の発現を誘発または抑制する可能性がある。スフェロイド浸潤アッセイは、癌細胞浸潤を研究するための適切な 3D in vitro 法を提供するために開発された。現在、動物由来マトリックスは、マウス肉腫由来マトリックス (MSDM) およびラットテールタイプ I 型コラーゲンなど、主にスフェロイドの侵襲アッセイにおいて使用されている。ヒト腫瘍微小環境と動物由来マトリックスとの違いを考慮して、良性子宮平滑筋腫組織からヒト子宮筋腫由来マトリックス (HMDM) が開発された。HMDM が MSDM よりも癌細胞の遊走と浸潤を誘導することが示されている。このプロトコルは、HMDM/フィブリンマトリクスを使用して簡単で、再現性があり、かつ信頼性の高い3D ヒト腫瘍ベースのスフェロイドの侵襲アッセイを提供した。また、イメージングと分析に関する詳細な説明も含まれています。スフェロイドは HMDM/フィブリンマトリックス内の U 字形超低アタッチメントプレートに生育し、それを介して侵入する。侵略は ilastik およびフィジーの ImageJ ソフトウェアを使用して毎日イメージし、測定し、そして分析される。アッセイプラットフォームは、ヒト喉頭原発および転移性扁平上皮癌細胞株を用いて示された。しかし、このプロトコルは他の固形癌細胞株にも適している。
従来の二次元 (2D) 細胞培養研究は、がん研究に大きく貢献してきました。現在、研究者は、インビボ条件1をよりよく模倣するために三次元 (3d) 細胞培養アッセイに向けてより多くシフトしている。3d 癌細胞培養は、細胞細胞および細胞マトリックス相互作用の点で複雑な腫瘍微小環境をより正確に反映し、遺伝子発現プロファイル、薬剤感受性、およびシグナル伝達経路活性2,3である。
いくつかの3d 細胞培養モデルは、腫瘍組織 explant、チップ上の腫瘍、多細胞腫瘍スフェロイドの3,4などの癌研究に使用されている。多細胞腫瘍スフェロイドは現在広く使用されており、ヒト腫瘍1,5におけるインビボ条件のいくつかの特徴を模倣している。スフェロイド径が500μ m を超えると、低酸素領域や壊死中心も有しており、このようにインビボ腫瘍状況2を表す。
多くの合成物 (例えば、ポリジメチルシロキサン) および動物由来の (例えば、ラットテールタイプ I コラーゲンおよびマウス肉腫由来マトリックス、マトリゲル、MSDM と称される) マトリクスが、3d 細胞培養アッセイ3、6のために開発された、 7、8。これまでのところ、市販のマトリクスはいずれもヒト腫瘍組織から生じたものではない。したがって、それらは、ヒト腫瘍微小環境の特徴を欠く、癌細胞浸潤プロセス8に著しい影響を及ぼす。
Myogel (ヒト子宮筋腫由来マトリックスは、HMDM と称される) をヒト子宮平滑筋腫腫瘍組織9から抽出する。HMDM のタンパク質含量は MSDM と大きく異なることが示されている。実際、HMDM タンパク質の 66% は、MSDM タンパク質とは異なります。一方、ラミニン、IV 型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、nidogen、および表皮成長因子などの一部のタンパク質は、両方のマトリクス10に存在している。さらに、マウスは酵素含量においてヒトとは異なり、ヒトはマウス11よりも78少ないプロテアーゼを有する。
フィブリンは、足場材料12として単独または他の材料と組み合わせて広く使用されてきた。3D 細胞培養アッセイにおいて、商業的に入手可能なヒトのフィブリノーゲンおよびトロンビンは、フィブリンヒドロゲル12を形成するように結合される。
このプロトコルは、以前に導入された3D 腫瘍スフェロイドの浸潤アッセイ7の改善を説明する。この新しいプロトコルは、マウス由来腫瘍マトリックスの代わりにヒト腫瘍由来マトリックスを適用する。また、ilastik およびフィジー ImageJ ソフトウェアを使用したイメージングおよび解析技術も含まれます。このプロトコルは、いくつかの異なる固形癌細胞株のスフェロイドアッセイに使用することができる。それは新しい抗癌療法を開発し、癌細胞の侵略に特定の分子の効果を研究するために生物学的に関連した用具を提供する。
提示された方法は、d 型ヒト腫瘍ベースのアッセイを提供して、母体のヒト腫瘍微小環境内の癌細胞の侵襲性を評価する。がん細胞の侵襲は、標準的な顕微鏡を用いた毎日のイメージングと、画像解析ソフトウェアによって容易に測定することができます。この方法は単なる増殖ではなく細胞浸潤を示す。
MSDM とは異なり、HMDM/フィブリンマトリックスは、任意の温度制御を必要としません。この方法は、特に1つのプレートから別にスフェロイドを転送する必要なく、実行するのは簡単です。それは唯一の技術的に敏感なステップ、マトリックスへのフィブリノーゲンの添加を持っています。フィブリノーゲンは数分後にゲル化し始めるので、フィブリノーゲンを加えると、一度にわずかな井戸をピペットで処理し、治療する必要があります。また、ピペット操作が高圧で行われる場合、スフェロイドを妨害して U 字型の中央位置から移動させるリスクもあります。回転楕円体の脱臼は、画像化および最終的に分析を複雑にすることができる。
アッセイは、HMDM またはフィブリノーゲンの濃度を変えることによって修飾することができます。細胞はまた、その後の分子研究のために固定および染色することができる。この方法は完全に自動化された形に変更することができますが、通常の顕微鏡と2つのオープンソースソフトウェアで行うこともでき、高価な装置は必要ありません。
従来の MSDM ベースの3D アッセイと比較して、このアッセイは細胞の浸潤特性をより良く表示することができます。MSDM のようなラミニンが豊富なマトリクスを含む基底膜で成長したスフェロイドは、実際の侵襲よりも癌細胞の増殖が多くなり、それが侵入能力が低いためにいくつかの癌細胞株における浸潤アッセイには適さない可能性がある。もう1つの頻繁に使用されるマトリックスである I 型コラーゲンは、3D 培養中にエッジから収縮する傾向があり、これは、回転楕円体の局在化およびウェルの画像化に影響を及ぼす。さらに、より多くの (HSC-3) およびより少ない (SCC-25) 攻撃的な舌の癌の細胞株の内因性の侵襲的特性の違いはモデル (子宮筋腫ディスクおよびその可溶性形態マトリックス)10、13。
HMDM はヒト平滑筋腫腫瘍の余った物質から抽出されるので、アッセイは MSDM を使用するよりも倫理的です。現在、HMDM は、多くの癌関連臨床アッセイ8、10に適していると思われる唯一の利用可能なヒト腫瘍由来 ECM 産物である。将来的には、動物の組織由来マトリックスをヒト腫瘍ベースのマトリックスに置き換えることができ、マトリックス生産のために動物を犠牲にする必要性を減らすことができる。
2D 細胞培養アッセイを3D 法で置き換えることで、がん細胞の挙動に関するより正確な情報が得られます。現在、いくつかの3D モデルと商業的なマトリックスがありますが、残念ながら、どれもすべてのがん細胞株に適していません。研究者は、特定のアッセイに最適なマトリックスを選択する必要があります。アッセイとマトリックスの最適なマッチングは困難な場合がありますが、結果の信頼性が大幅に向上する可能性があります。
The authors have nothing to disclose.
著者は、この研究の資金に感謝します: シグリッド Jusélius 財団、フィンランド癌協会、ヘルシンキ大学中央病院の研究資金。著者らは、技術支援のためにヘルシンキ大学で Biomedicum イメージングユニットを承認しています。
Amphotericin B solution | Merck | A2942 | |
Aprotinin from bovine lung | Merck | A6279 | Measure the protein concentration before use. |
Ascorbic acid | Applichem | A1052 | |
BioLite Cell Culture Treated Flasks | Thermo Scientific | 130190 | |
DMEM/F-12 | Gibco by Life Technologies | 31330-038 | |
DS-Fi2 Digital Camera | Nikon Instruments | ||
DS-U3 Digital Camera Controller | Nikon Instruments | ||
Eclipse TS100 Inverted Microscope | Nikon Instruments | ||
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco by Life Technologies | 10270106 | Heat inactivate for 30 min at 56°C in waterbath before use. |
Fibrinogen, Plasminogen-Depleted, Human Plasma | Merck | 341578 | Solubility: 25 mg/ml in H₂O. Warm the H₂O and the fibrinogen to 37°C prior to dissolution. Do not disturb until the fibrinogen is completely solubilized. Stock solutions stored at -70°C should be thawed in a water bath maintained at 37°C. |
Fiji ImageJ 1.51 image processing program | Freeware, NIH | ||
Hydrocortisone | Merck | H0888 | |
Ilastik software for image classification and segmentation | Freeware | ||
IncuCyte Zoom Live-Cell Analysis System | Essen BioScience | ||
Myogel | Lab made | ||
Penicillin-Streptomycin | Gibco by Life Technologies | 15140-122 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Lab made | ||
Scepter 2.0 Cell Counter | Merck | PHCC20040 | |
Scepter Cell Counter Sensors, 60 µm | Merck | PHCC60050 | |
Thrombin from human plasma | Merck | T6884-100UN | |
Trypsin-EDTA (0.5%) 10X, no phenol red | Gibco by Life Technologies | 15400054 | |
Ultra-Low Attachment 96-Well Plate | Corning | 7007 | |
UT-SCC-42A and UT-SCC-42-B cell lines | The cell lines were established at the Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Turku University Hospital (Turku, Finland). |