Summary

לוקליזציה של חלבונים ששונו באמצעות סומו פלורסנט-השמנה חלבונים

Published: April 27, 2019
doi:

Summary

סומו הוא הכרחי ושמרו במידה רבה, חלבון שימור קטן כמו הצירוף. בפרוטוקול זה אנו מתארים את השימוש רקומביננטי העמידות בפני סומו חלבון השמנה להשמנה (kmUTAG) כדי להמחיש מקורי, שערי סומו לא מתויגים ולוקליזציה שלהם במגוון סוגי תאים.

Abstract

כאן אנו מציגים שיטה מקורית לחקר הסורחון של חלבונים ולוקליזציה התת-תאית שלהם בתאי היונקים והנוציטים. שיטה זו מנצלת רקומביננטי שונה חלבון השמנה משבר, kmUTAG, נגזר פרוטאז Ulp1 סומו של הלחץ עמידים שמרים הmarxianus. התאמתי את המאפיינים של kmUTAG למטרת לימוד סומולציה במגוון מערכות מודל ללא שימוש בנוגדנים. למחקר של סומו, KmUTAG יש כמה יתרונות כאשר לעומת הגישות מבוססות נוגדן. זה מאוד עמידים להשמנה סומו השמנה מופק recombinantly, הוא מזהה איזופורמים מקורי של מינים רבים, ובניגוד נוגדנים זמין מסחרית זה מראה זיקה מופחתת עבור סומו בחינם, מצומת. תוצאות הנציגה המוצגות כאן כוללות לוקליזציה של שערי מעלה סומו בתאי תרבות של רקמת היונקים ו נמטודות אוציטים.

Introduction

מטרת שיטה זו היא להקל על המחקר והניתוח של חלבונים סומו מצובגים באמצעות רקומביננטי הסומו השמנה UTAG (Ulp בתחום תג) חלבון. כפי שמפורט להלן, UTAG ניתן להשתמש במקום של ריאגנטים אחרים וגישות לטהר, לזהות, ולדמיין חלבונים ששונו סומו. בהתאם לתנאי הגדילה, תאים עשויים להכיל מאות או אלפי חלבונים שהשתנו עם שרשראות סומו או סומו (לסקירה ראה קרשר ואח ‘ 20061 ו kerscher 20162). זה מייצג קושי ניכר עבור ניתוחים פונקציונליים של חלבונים ספציפיים ששונו הסומו, במיוחד מאז רק חלק של היעד מסוים sumoylation שונה למעשה3. בנוסף לתפקידם בתהליכים סלולאריים חיוניים כגון רגולציה, הומאוסטזיס חלבון, התגובה למתח הסלולר, ושיפוץ כרומטין במהלך מיטוזיס ומיוזיס; עכשיו זה הופך מספיק ברור כי סומו, סומו שונה חלבונים, ורכיבים מסלול סומו יש גם פוטנציאל של ביואריקרס לפתווגיות כגון סרטן והפרעות ניווניות4,5,6 ,7. זה מדגיש את הצורך חזק, אמין, כלים זמינים וגישות חדשניות עבור זיהוי וניתוח פונקציונלי של חלבונים ששונו סומו במגוון של תאים ודגימות.

במערכות רבות, נוגדנים ספציפיים סומו הם ריאגנטים של בחירה עבור איתור, בידוד וניתוחים פונקציונליים של חלבונים ששונו סומו8,9. עם זאת, כמה נוגדנים מסחריים ספציפיים סומו מסוימים הם יקרים, מוגבל בכמות או זמינות, נוטה להציג משתנה בפראות משתנים ופעילות צולבת, ובמקרים מסוימים חוסר התוכנות10. גישה חלופית אחת היא הביטוי של אפירופה-מתויג סומו בתאים ואורגניזמים שעברו שינוי, אך הקישור תגי אפירופה לסומו עשוי באופן מלאכותי להקטין את הקוניוגציה למטרות חלבונים11. בנוסף, האפיסקופים אינם שימושיים כאשר מוערכים תאים או רקמות שאינם משתנים.

Ulp1 הוא פרוטאז סומו שימור מ -S. cerevisiae ס כי שני התהליכים הקודמן סומו ו desumoylates סומו מצווים חלבונים12. פיתחנו את מגיב UTAG מבוסס על התבוננות קרי כי מוטציה של ציסטיין קטליטי (C580S) ב Ulp1’s הסומו עיבוד Ulp domain (עוד) לא רק מונע מחשוף סומו אלא גם מלכודות סומו-מצועם חלבונים עם גבוה ובכן12. למען הפשטות, התייחסנו לUlp1 האלה להשמנה של סומו מסופים, בדומה ל-UTAG (קיצור של UD TAG). UTAG הוא חלבון רקומביננטי פאן-סומו השמנה המייצגת חלופה שימושית לנוגדנים אנטי סומו המשמשים לבידוד ואיתור של חלבונים ששונו סומו. וחשוב מכך, הוא מזהה באופן מקורי-מקופל, סומו מצופלת ולא רק אפיסקופים אחד או מספר על סומו. כדי לשפר הן את יציבות החלבון ואת חוזק כריכת סומו של UTAG, יצרנו גרסה של UTAG מן הלחץ עמידים שמרים Kluyveromyces marxianus (ק מ). KmUTAG נקשר בחוזקה סומו-מבצוערים עם זיקה nanomolar13. בנוסף, kmUTAG עמיד בטמפרטורות גבוהות (42 ° c), הפחתת סוכנים (5 מ”מ TCEP-טריס (2-carboxyethyl) פוספלין הידרוכללוריד), denaturants (עד 2 שתנן), סוכני אוקסיגון (0.6% תחמוצת מימן), וחומרי ניקוי לא יוניים. סובלנות זו מועילה במהלך מצב טיהור קשה וזמני דגירה ממושכים, ומבטיחים את היציבות ופעילות ההשמנה של הסומו. לא באופן מפתיע, עם זאת, הפעילות לכידת סומו של KmUTAG אינו תואם את cysteine שינוי ריאגנטים, חומרי ניקוי יוניים ותמציות חלבון מלאה. האהדה והתכונות היוצאות מהכלל של KmUTAG מעידות על כך שניתן להפוך את הדבר לחלק מהרפרטואר הסטנדרטי לחקר חלבונים מסוחיים במינים מרובים.

כאן אנו מספקים שיטה פשוטה כדי לזהות חלבונים ששונו הסומו בתאי היונקים והנטודות באמצעות רקומביננטי פלורסנט mCherry-KmUTAG פיוז’ן חלבון (kmUTAG-fl).

Protocol

1. איתור סומו בתאי תרבות קבועה ברקמה באמצעות רקומביננטי KmUTAG-FL חלבון השמנה להשמנה הגדל תאים התרבות הרקמה של בחירה על 22 מילימטר עגול לכסות מחליק 6-היטב לוחות TC עד 70% – 80% confluent. בצע את שלבים 1.2 – 1.8 בצלחת 6-באר. לשטוף את התאים בקצרה עם 1 מ ל של DPBS (מלוחים פוספט באגירה של דולבקו) עבור ק…

Representative Results

KmUTAG-fl הוא רקומביננטי, החלבון מתויג להשמנה סומו. כדי לייצר kmUTAG-fl, שירמנו מיטוב codon ממוטבת-kmUTAG לתוך הpSPOT1 בקטריאלי בקטריות ביטואמצע (איור 1). לאחר האינדוקציה, החלבון kmUTAG-fl היה מטוהר במלכודת ספוט, שהוקפא והוקפא עד לשימוש נוסף. כדי להבטיח את הפעילות לכידת סומו של K…

Discussion

כאן אנו מציגים את השימוש של kmutag-fl, חלבון רקומביננטי, למחקרים פונקציונליים של סומו בתאי יונקים קבועים ובעל בלוטות המין נמטודות. KmUTAG-fl הוא מאוד עמידים ללחץ הפאן-סומו מגיב ספציפי מזהה ומלכודות מקורי סומו מצועם ושרשראות סומו. מאז המבנה השלישוני של סומו הוא שימור מאוד זה סביר מאוד כי משתנים סומ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו רוצים להודות לכל חברי מעבדת קרשר על תמיכתם, נטלי נגוין לקריאה קריטית של כתב היד, ו Lidia Epp לרצף. עבודה זו נתמכת על ידי קרן המיסחור מחקר של חבר העמים MF16-034-LS כדי OK. הסיוע במחקר לתלמידי W & M סופק על ידי קרן ביילי-יוסטון למחקר, ושארל סנטר כבוד מלגות ל-RY ו-CH.

Materials

16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution Electron Microscopy Sciences 30525-89-4
6-Well Cell Culture Plates Genesee Scientific/Olympus Plastics 25-105
Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 115-545-003 Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody
DPBS, no calcium, no magnesium Fisher Scientific Gibco 14190144
Dylight 488 conjugated AffiniPure Goat Anti-Moue IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 115-485-146 Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody
Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses Fisherbrand 12545101
FLUORO-GEL II with DAPI Electron Microscopy Sciences 50-246-93) Mounting media in step 1.11
FLUORO-GEL with DABCO Electron Microscopy Sciences 17985-02 With DAPI added to 1 µg/mL; mounting media in step 2.2.5
Glycine-HCl Fisher BioReagents BP3815
Glycine-HCl ACROS Organics 6000-43-7
KmUTAG-fl Kerafast KmUTAG reagents are available on Kerafast.com
Oneblock Western-CL blocking buffer Prometheus 20-313
PBS, Phosphate Buffered Saline, 10X Solution Fisher BioReagents BP3994
PNT2 cell line Sigma-Aldrich 95012613 Normal prostate epithelium immortalized with SV40.
pSPOT1 (ChromoTek GmbH) ev-1 https://www.chromotek.com/fileadmin/user_upload/pdfs/Datasheets/pSpot1_v1.pdf
SUMO 6F2 DSHB SUMO 6F2 SUMO 6F2 was deposited to the DSHB by Pelisch, F. / Hay, R.T. (DSHB Hybridoma Product SUMO 6F2)
SUMO protease buffer [10x] 500 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2% NP-40, 1.5 M NaCl
SUMO-2 Antibody 8A2 DSHB SUMO-2 8A2 SUMO-2 8A2 was deposited to the DSHB by Matunis, M. (DSHB Hybridoma Product SUMO-2 8A2)
TCEP-HCL GoldBio 51805-45-9 Used as a reducing agent at a concentration of 5mM
Triton X-100 Fisher BioReagents 9002-93-1 Used for permeablization at 0.1% in DPBS/PBS(for worms)

References

  1. Kerscher, O., Felberbaum, R., Hochstrasser, M. Modification of proteins by ubiquitin and ubiquitin-like proteins. Cell and Developmental Biology. 22, 159-180 (2006).
  2. Kerscher, O. . SUMOylation. , 1-11 (2016).
  3. Hay, R. T. SUMO: a history of modification. Molecular Cell. 18 (1), 1-12 (2005).
  4. Fu, J., et al. Disruption of SUMO-specific protease 2 induces mitochondria mediated neurodegeneration. PLoS Genetics. 10 (10), e1004579-e1004579 (2014).
  5. Zhang, H., Kuai, X., Ji, Z., Li, Z., Shi, R. Over-expression of small ubiquitin-related modifier-1 and sumoylated p53 in colon cancer. Cell biochemistry and biophysics. 67 (3), 1081-1087 (2013).
  6. Wang, Q., et al. SUMO-specific protease 1 promotes prostate cancer progression and metastasis. Oncogene. 32 (19), 2493-2498 (2013).
  7. Karami, S., et al. Novel SUMO-Protease SENP7S Regulates β-catenin Signaling and Mammary Epithelial Cell Transformation. Scientific Reports. 7 (1), 46477 (2017).
  8. Pelisch, F., et al. A SUMO-Dependent Protein Network Regulates Chromosome Congression during Oocyte Meiosis. Molecular Cell. 65 (1), 66-77 (2017).
  9. Zhang, X. D., et al. SUMO-2/3 modification and binding regulate the association of CENP-E with kinetochores and progression through mitosis. Molecular Cell. 29 (6), 729-741 (2008).
  10. Baker, M. Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies. Nature News. 521 (7552), 274-276 (2015).
  11. Wang, Z., Prelich, G. Quality control of a transcriptional regulator by SUMO-targeted degradation. Molecular and Cellular Biology. 29 (7), 1694-1706 (2009).
  12. Li, S. J., Hochstrasser, M. A new protease required for cell-cycle progression in yeast. Nature. 398 (6724), 246-251 (1999).
  13. Peek, J., et al. SUMO targeting of a stress-tolerant Ulp1 SUMO protease. PLoS ONE. 13 (1), e0191391 (2018).
  14. Edgar, L. G. Chapter 13 Blastomere Culture and Analysis. Methods in Cell Biology. 48, 303-321 (1995).
  15. Pelisch, F., et al. Dynamic SUMO modification regulates mitotic chromosome assembly and cell cycle progression in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 5 (1), 769 (2014).
  16. Dillingham, M. S., et al. Fluorescent single-stranded DNA binding protein as a probe for sensitive, real-time assays of helicase activity. Biophysical Journal. 95 (7), 3330-3339 (2008).
  17. Ruckman, J., et al. 2′-Fluoropyrimidine RNA-based aptamers to the 165-amino acid form of vascular endothelial growth factor (VEGF165). Inhibition of receptor binding and VEGF-induced vascular permeability through interactions requiring the exon 7-encoded domain. The Journal of Biological Chemistry. 273 (32), 20556-20567 (1998).
  18. Hughes, D. J., et al. Generation of specific inhibitors of SUMO-1- and SUMO-2/3-mediated protein-protein interactions using Affimer (Adhiron) technology. Science Signaling. 10 (505), eaaj2005 (2017).
  19. Lopata, A., et al. Affimer proteins for F-actin: novel affinity reagents that label F-actin in live and fixed cells. Scientific Reports. 8 (1), 6572 (2018).
  20. Gilbreth, R. N., et al. Isoform-specific monobody inhibitors of small ubiquitin-related modifiers engineered using structure-guided library design. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7751-7756 (2011).
  21. Berndt, A., Wilkinson, K. A., Heimann, M. J., Bishop, P., Henley, J. M. In vivo characterization of the properties of SUMO1-specific monobodies. Biochemical Journal. 456 (3), 385-395 (2013).

Play Video

Cite This Article
Yin, R., Harvey, C., Shakes, D. C., Kerscher, O. Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins. J. Vis. Exp. (146), e59576, doi:10.3791/59576 (2019).

View Video