Lokalisering av SUMO-modifierade proteiner med fluorescerande Sumo-fångst proteiner
Summary
SUMO är ett viktigt och starkt bevarade, små ubiquitinliknande modifierande protein. I detta protokoll beskriver vi användningen av ett stress-tolerant rekombinant SUMO-svällningsprotein (kmUTAG) för att visualisera infödda, otaggade SUMO-konjugat och deras lokalisering i en mängd olika cell typer.
Abstract
Här presenterar vi en ny metod för att studera sumoylering av proteiner och deras sub-cellulär lokalisering i däggdjurs celler och tallvedsnematoden oocyter. Denna metod använder en rekombinant modifierad SUMO-svällning protein fragment, kmUTAG, som härrör från Ulp1 SUMO proteas av stress-toleranta spirande jäst Kluyveromyces marxianus. Vi har anpassat Kmutags egenskaper i syfte att studera sumoylering i en mängd olika modell system utan användning av anti kroppar. För studien av SUMO har KmUTAG flera fördelar jämfört med antikroppsbaserade metoder. Detta stress-toleranta SUMO-svällningsreagens produceras rekombinantly, det erkänner infödda SUMO ISO former från många arter, och till skillnad från kommersiellt tillgängliga anti kroppar det visar minskad affinitet för fri, okonjugerad SUMO. Representativa resultat som visas här inkluderar lokaliseringen av SUMO-konjugat i däggdjurs vävnads odlings celler och nematodeoocyter.
Introduction
Syftet med denna metod är att under lätta studier och analys av SUMO-konjugerade proteiner med hjälp av rekombinant SUMO-svällning UTAG (Ulp Domain tag) protein. Som beskrivs nedan kan UTAG användas i stället för andra reagenser och metoder för att rena, upptäcka och visualisera SUMO-modifierade proteiner. Beroende på tillväxt förhållanden, celler kan innehålla hundratals eller tusentals proteiner som modifieras med SUMO eller SUMO kedjor (för granskning se Kerscher et al. 20061 och kerscher 20162). Detta utgör en avsevärd svårighet för funktionella analyser av specifika SUMO-modifierade proteiner, särskilt eftersom endast en bråkdel av en viss sumoylation mål faktiskt ändras3. Förutom deras roller i viktiga cellulära processer såsom transkriptionell reglering, protein homeostas, reaktionen på cellulär stress, och kromatin remodeling under Mitosen och meiosis; Det har nu blivit tillräckligt tydligt att Sumo, Sumo-modifierade proteiner och Sumo-utbildningsavsnitt också har potential som bio markörer för sjukdomar som cancer och neurodegenerativa sjukdomar4,5,6 ,7. Detta understryker behovet av robusta, pålitliga och lättillgängliga verktyg och innovativa metoder för detektion och funktionell analys av SUMO-modifierade proteiner i en mängd olika celler och prover.
I många system är sumospecifika anti kroppar de reagenser som är val för detektion, isolering och funktionella analyser av Sumo-modifierade proteiner8,9. Vissa kommersiellt tillgängliga SUMO-specifika anti kroppar är dock dyra, begränsade i kvantitet eller tillgänglighet, benägna att uppvisa vilt variabla affiniteter och kors reaktivitet, och i vissa fall saknar reproducerbarhet10. En alternativ metod är uttrycket av epitop-taggade Sumo i transformerade celler och organismer, men länka epitop Taggar till Sumo kan artificiellt sänka sin konjugering till protein mål11. Dessutom är epitoper inte användbart när otransformerade celler eller vävnader utvärderas.
Ulp1 är en conserveras SUMO proteashämmare från S. cerevisiae att både bearbetar Sumo föregångaren och desumoylates Sumo-konjugerade proteiner12. Vi utvecklade utag reagens baserat på den serendipitous observation att en mutation av den katalytiska Cystein (C580S) i Ulp1’s Sumo bearbetning Ulp domänen (UD) inte bara förhindrar Sumo klyvning men också fällor Sumo-konjugerade proteiner med hög aviditet12. För enkelhetens skull hänvisade vi till denna carboxy-Terminal SUMO-svällning Ulp1 (C580S) fragment som UTAG (förkortning för UD TAG). UTAG är ett rekombinant Pan-SUMO-svällningsprotein som utgör ett användbart alternativ till anti-SUMO-antikroppar som används för isolering och detektion av SUMO-modifierade proteiner. Viktigt är att det specifikt erkänner Native-vikas, konjugerad Sumo och inte bara en eller flera epitoper på Sumo. För att förbättra både protein stabilitet och SUMO bindande styrka UTAG, genererade vi en variant av UTAG från stress-toleranta jäst Kluyveromyces marxianus (km). Kmutag binder tätt Sumo-konjugat med HDAC vid nanomolära affinitet13. KmUTAG är dessutom resistent mot förhöjda temperaturer (42 ° c), Reduktions medel (5 mM TCEP-tris (2-carboxyeyl) fosfinhydroklorid), denatureringsmedel (upp till 2 M urea), oxidations medel (0,6% väteperoxid) och icke-joniska rengörings medel. Denna stress tålighet är fördelaktig under hårda renings förhållanden och förlängda inkubations tider, vilket säkerställer dess stabilitet och SUMO-svällningsaktivitet. Det är dock inte överraskande att Kmutags SUMO-svällningsaktivitet är oförenlig med Cystein-modifierande reagenser, joniska rengörings medel och helt denaturerade protein extrakt. Kmutags anmärknings värda affinitet och egenskaper tyder på att denna reagens kan bli en del av standardrepertoaren för studiet av sumoylerade proteiner i flera arter.
Här erbjuder vi en enkel metod för att detektera SUMO-modifierade proteiner i däggdjurs celler och nematoder med hjälp av ett rekombinant fluorescerande mCherry-KmUTAG fusions protein (kmUTAG-fl).
Protocol
Representative Results
Discussion
Här introducerar vi användningen av kmUTAG-fl, ett rekombinant protein, för funktionella studier av SUMO i fasta däggdjurs celler och dissekerade tallvedsnematoden gonader. KmUTAG-fl är en stress-tolerant Pan-SUMO specifik reagens som känner igen och fällor infödda SUMO-konjugerade proteiner och SUMO kedjor. Eftersom SUMO ‘ s tertiär struktur är mycket bevarade är det mycket troligt att SUMO varianter från ytterligare modell och icke-modellsystem kan analyseras med kmUTAG-fl reagens. KmUTAG-fl kan utgöra en …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka alla medlemmar i Kerscher labbet för deras stöd, Nathalie Nguyen för kritisk läsning av manuskriptet, och Lidia EPP för sekvensering. Detta arbete har fått stöd av Samväldets forsknings kommersialiserings fond MF16-034-LS till OK. Forsknings stöd för W & M studenter tillhandahölls av Bailey-Huston Research Fund, och Charles Center Honors Fellowships till RY och CH.
Materials
| 16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 30525-89-4 | |
| 6-Well Cell Culture Plates | Genesee Scientific/Olympus Plastics | 25-105 | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-545-003 | Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Fisher Scientific | Gibco 14190144 | |
| Dylight 488 conjugated AffiniPure Goat Anti-Moue IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-485-146 | Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody |
| Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses | Fisherbrand | 12545101 | |
| FLUORO-GEL II with DAPI | Electron Microscopy Sciences | 50-246-93) | Mounting media in step 1.11 |
| FLUORO-GEL with DABCO | Electron Microscopy Sciences | 17985-02 | With DAPI added to 1 µg/mL; mounting media in step 2.2.5 |
| Glycine-HCl | Fisher BioReagents | BP3815 | |
| Glycine-HCl | ACROS Organics | 6000-43-7 | |
| KmUTAG-fl | Kerafast | KmUTAG reagents are available on Kerafast.com | |
| Oneblock Western-CL blocking buffer | Prometheus | 20-313 | |
| PBS, Phosphate Buffered Saline, 10X Solution | Fisher BioReagents | BP3994 | |
| PNT2 cell line | Sigma-Aldrich | 95012613 | Normal prostate epithelium immortalized with SV40. |
| pSPOT1 | (ChromoTek GmbH) | ev-1 | https://www.chromotek.com/fileadmin/user_upload/pdfs/Datasheets/pSpot1_v1.pdf |
| SUMO 6F2 | DSHB | SUMO 6F2 | SUMO 6F2 was deposited to the DSHB by Pelisch, F. / Hay, R.T. (DSHB Hybridoma Product SUMO 6F2) |
| SUMO protease buffer [10x] | 500 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2% NP-40, 1.5 M NaCl | ||
| SUMO-2 Antibody 8A2 | DSHB | SUMO-2 8A2 | SUMO-2 8A2 was deposited to the DSHB by Matunis, M. (DSHB Hybridoma Product SUMO-2 8A2) |
| TCEP-HCL | GoldBio | 51805-45-9 | Used as a reducing agent at a concentration of 5mM |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | 9002-93-1 | Used for permeablization at 0.1% in DPBS/PBS(for worms) |
References
- Kerscher, O., Felberbaum, R., Hochstrasser, M. Modification of proteins by ubiquitin and ubiquitin-like proteins. Cell and Developmental Biology. 22, 159-180 (2006).
- Kerscher, O. . SUMOylation. , 1-11 (2016).
- Hay, R. T. SUMO: a history of modification. Molecular Cell. 18 (1), 1-12 (2005).
- Fu, J., et al. Disruption of SUMO-specific protease 2 induces mitochondria mediated neurodegeneration. PLoS Genetics. 10 (10), e1004579-e1004579 (2014).
- Zhang, H., Kuai, X., Ji, Z., Li, Z., Shi, R. Over-expression of small ubiquitin-related modifier-1 and sumoylated p53 in colon cancer. Cell biochemistry and biophysics. 67 (3), 1081-1087 (2013).
- Wang, Q., et al. SUMO-specific protease 1 promotes prostate cancer progression and metastasis. Oncogene. 32 (19), 2493-2498 (2013).
- Karami, S., et al. Novel SUMO-Protease SENP7S Regulates β-catenin Signaling and Mammary Epithelial Cell Transformation. Scientific Reports. 7 (1), 46477 (2017).
- Pelisch, F., et al. A SUMO-Dependent Protein Network Regulates Chromosome Congression during Oocyte Meiosis. Molecular Cell. 65 (1), 66-77 (2017).
- Zhang, X. D., et al. SUMO-2/3 modification and binding regulate the association of CENP-E with kinetochores and progression through mitosis. Molecular Cell. 29 (6), 729-741 (2008).
- Baker, M. Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies. Nature News. 521 (7552), 274-276 (2015).
- Wang, Z., Prelich, G. Quality control of a transcriptional regulator by SUMO-targeted degradation. Molecular and Cellular Biology. 29 (7), 1694-1706 (2009).
- Li, S. J., Hochstrasser, M. A new protease required for cell-cycle progression in yeast. Nature. 398 (6724), 246-251 (1999).
- Peek, J., et al. SUMO targeting of a stress-tolerant Ulp1 SUMO protease. PLoS ONE. 13 (1), e0191391 (2018).
- Edgar, L. G. Chapter 13 Blastomere Culture and Analysis. Methods in Cell Biology. 48, 303-321 (1995).
- Pelisch, F., et al. Dynamic SUMO modification regulates mitotic chromosome assembly and cell cycle progression in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 5 (1), 769 (2014).
- Dillingham, M. S., et al. Fluorescent single-stranded DNA binding protein as a probe for sensitive, real-time assays of helicase activity. Biophysical Journal. 95 (7), 3330-3339 (2008).
- Ruckman, J., et al. 2′-Fluoropyrimidine RNA-based aptamers to the 165-amino acid form of vascular endothelial growth factor (VEGF165). Inhibition of receptor binding and VEGF-induced vascular permeability through interactions requiring the exon 7-encoded domain. The Journal of Biological Chemistry. 273 (32), 20556-20567 (1998).
- Hughes, D. J., et al. Generation of specific inhibitors of SUMO-1- and SUMO-2/3-mediated protein-protein interactions using Affimer (Adhiron) technology. Science Signaling. 10 (505), eaaj2005 (2017).
- Lopata, A., et al. Affimer proteins for F-actin: novel affinity reagents that label F-actin in live and fixed cells. Scientific Reports. 8 (1), 6572 (2018).
- Gilbreth, R. N., et al. Isoform-specific monobody inhibitors of small ubiquitin-related modifiers engineered using structure-guided library design. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7751-7756 (2011).
- Berndt, A., Wilkinson, K. A., Heimann, M. J., Bishop, P., Henley, J. M. In vivo characterization of the properties of SUMO1-specific monobodies. Biochemical Journal. 456 (3), 385-395 (2013).
