Summary

Лентивирные посредничества Джин Silencing в человека Pseudoislet Подготовлено в низких пластин присоединения

Published: May 14, 2019
doi:

Summary

Представлен протокол для создания геномодифицированных человеческих псевдоизоляторов из рассеянных клеток островков человека, которые переводятся лецивирусом, несущим короткую ШПильку РНК (shRNA). Этот протокол использует легко доступные ферменты и культурные сосуды, может быть выполнена легко, и производит генетически модифицированные человеческие псевдоизоляторы, пригодные для функциональных и морфологических исследований.

Abstract

Различные генетические инструменты доступны для модулирования генов в островках поджелудочной железы грызунов для вскрытия функции островковых генов для исследования диабета. Однако данные, полученные с островков грызунов, часто не полностью воспроизводятся или применимы к островкам человека из-за хорошо известных различий в структуре и функции островка между видами. В настоящее время методы, доступные для манипулирования экспрессией генов человеческих островков, очень ограничены. Введение трансгена в нетронутые островки аденовирусом, плазмидом и олигонуклеотидами часто страдает от низкой эффективности и высокой токсичности. Низкая эффективность особенно проблематична в исследованиях по снижению генов в нетронутых островках, которые требуют высокой эффективности. Было известно, что ферментативно-рассеянные островковые клетки реагрегируются в культуре формирования сфероидов, называемых псевдоислетами. Контролируемые размером реагрегации клеток островка человека создают псевдоизоляторы, которые поддерживают динамическую секрецию инсулина первой фазы после длительной культуры и обеспечивают окно для эффективного введения лентивирусной короткой ШПильки РНК (SHRNA) с низкой токсичностью. Здесь описан подробный протокол для создания человеческих псевдоислетов после трансдукции ллентивиров с использованием двух коммерчески доступных мультивеллных пластин. Протокол может быть легко выполнен и позволяет эффективно едить внизрегулрецию генов и оценку динамизма секреции инсулина с использованием человеческих клеток-разлеток. Таким образом, человеческие псевдоизоляторы с опосредованной генной модуляцией обеспечивают мощную и универсальную модель для оценки функции генов в клетках островков человека.

Introduction

Потеря функциональной бета-клеточной массы является центральной патологией какдля диабета типа 1, так и для 2-го типа 1. В то время как бета-клетки являются производителями инсулина в островках поджелудочной железы, связь между бета-клетками и небета-клетками играет важную роль в регуляции секреции инсулина2. Кроме того, дисрегуляция секреции глюкагона способствует гипергликемии при диабете3. Таким образом, существует большой интерес к модулировать экспрессию генов клеток в островках поджелудочной железы для решения механизма развития дисфункции островка при диабете. Различные подходы, включая трансгенных мышей доступны для модулировать экспрессию генов островков мыши. Тем не менее, человек и мышь островки показывают различные иннервации, распределение клеток, соотношение бета-клеток к альфа-клетки, и ответ на secretagogues4. Поэтому прямая оценка функции генов в островках человека чрезвычайно важна для понимания патофизиологии островков поджелудочной железы человека.

Аденовирусный вектор является наиболее широко используемым вирусным вектором для претворения островков поджелудочной железы в пробирке из-за высокой эффективности трансдукции в неразделяющихся клетках. Однако аденовирус не проникает в ядро островков эффективно, особенно в островки человека5,и является цитотоксическим в высоких дозах6. Сравнительно, лентивирусный вектор менее цитотоксичен и поставляет экзогенные гены постоянно в хромосому пост-митотических клеток, что делает его широко проверенным средством для генной терапии7. Тем не менее, способность лентивирус проникнуть в ядро нетронутых островков человека также ограничена, тем самым требуя частичной дисперсии путем ферментативного пищеварения для повышения эффективности трансдукции8. Предостережение с дисперсией нетронутых островков человека прерывание клеток и клеточной матрицы связи, которая ставит под угрозу динамическую регуляцию секреции инсулина решающее значение для поддержания гомеостаза глюкозы у людей9. Таким образом, было сложно оценить влияние модуляции генов на динамическую регуляцию островковой функции в модели островков человека.

Известно, что рассеянные островков ы токсы с островков человека и грызунов автономно реагрегатируются на островоподобные структуры, называемые «псевдоизлетами». Псевдоислеты показывают бета-и небета-клеточная дистрибуция, аналогичная родному островкам10,11. Кроме того, после долговременной культуры, родные островкипостепенно теряют надежную первую фазу секреции инсулина 5,10,11,12. Тем не менее, псевдоизлеты продемонстрировали лучшее сохранение секреции инсулина первой фазы в ответ на глюкозу по сравнению с местными островками после того же периода культуры5. В дополнение к лучшей секреции инсулина, контролируемые размером реагрегации клеток человека в низких пластинах крепления11 предоставляет окно возможностей для введения лентивирусных векторов до их реагрегации в псевдовизлеты. Несколько исследований продемонстрировали полезность псевдоизлетов в сочетании с опосредования трансдукции лентивиральной. Caton et al.13 сообщили, что введение зеленого флуоресцентного белка (GFP), выражающего лентивирус, мало повлияло на секрецию инсулина при достижении однородного выражения ГФП в крысиных псевдоислетах по сравнению с неинфицированным контролем. Они также продемонстрировали специфическое влияние различных connexins на секрецию инсулина путем overexpressing connexins 32, 36, и 43 через lentivirus13. Человеческие псевдовизлеты, подготовленные с коммерчески доступной 96-хорошо ультра-низкой пластины крепления показали, что lentiviral-опосредованное переэкспрессия транскрипционного фактора SIX3 улучшает секрецию инсулина оценивается статической инкубации14. Недавно, человеческие псевдовизлеты, подготовленные с 96-хорошо ультра-низкой пластины крепления были использованы для downregulate глюкокиназы через lentiviral короткой шпильки РНК (SHRNA) в качестве доказательства принципа, чтобы показать, что глюкоза стимулировали секреции инсулина уменьшается, в то время как KCl-стимулировали секрецию инсулина была сохранена5. Исследование также показало, что человеческие псевдоизоляторы похожи на родние островки в экспрессии генов и секреторных профилях, что еще больше поддерживает полезность человеческих псевдоизлетов для вскрытия регуляции островной функции5. Хотя перифузия не была выполнена, биоинженерных микроколодцы культуры пластины, которые недавно стали коммерчески доступны, также сообщается, что совместимы для лентивирусной трансдукции и производства человеческих псевдоизоляторов, которые выставлены отличные инсулина секреция in vitro и in vivo после трансплантации11. В совокупности, формирование человеческого псевдоистлета в сочетании с лентивирусной трансдукцией является простым и эффективным подходом к исследованию патологиологии островков человека, обеспечивая ценный инструмент для проведения механистических исследований на человеческих островках.

В настоящем докладе представлен протокол для формирования человеческих псевдоизоляторов, трансцизированных с помощью лентивирусной платформы, 96-хорошо ультра-низкой пластины крепления и микроколодцы культуры пластины. Оба достигают эффективной модуляции экспрессии генов и создают человеческие псевдоизоляторы, совместимые для оценки вниз по течению, включая статическое инкубацию и перифузию.

Protocol

До начала исследований, человеческие предметы исследования определение было сделано ВУниверситете штата Айова Институциональный обзор совета, который определил, что исследование не соответствует критериям для исследования человеческих субъектов. Проконсультируйтесь с местным наб?…

Representative Results

Рисунок 1 иллюстрирует ключевые шаги в производстве псевдоизлетов с использованием 96-хорошо ультра-низкой пластины крепления и микроколодцы культуры пластины. На рисунке 2а показаны последовательные изменения в морфологии при формир?…

Discussion

Здесь представлен подробный протокол для генерации человеческих псевдоизлетов, которые трансцируются с помощью 96-хорошо ультра-низкой пластины крепления или микроколодца культуры пластины. Псевдоизоляторы, как сообщается, демонстрируют морфологию и секреторные функции, похожие<sup cl…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была финансово поддержана Национальными институтами здравоохранения в Y.I. (R01-DK090490) и Американской диабетической ассоциацией в Y.I. (1-17-IBS-132). J.A. и Y.I. поддерживаются Братским Орденом Орловского Научно-исследовательского центра диабета. A.B. поддерживается грантом на обучение национальных институтов здравоохранения (T32NS45549). Авторы использовали островки поджелудочной железы человека, предоставленные финансируемой NIDDK Комплексной программой распределения островок (IIDP) в городе Надежда (2UC4DK098085).

Materials

Anti-adherence rinsing solution Stemcell technologies 7919
Biological safety cabinet Thermo Scientific 1300 Series Type A2
cell strainer, 40 micrometer Corning 431750
CMRL-1066 ThermoFisher 11530037
CO2 incubator Thermo Scientific Heracell VIOS 160i
conical centrifuge tube, 15 mL VWR 89039-666
conical centrifuge tube, 50 mL VWR 89039-658
fetal bovine serum ThermoFisher 26140079
guanidinium thiocyanate RNA extraction reagent ThermoFisher 15596026 Trizol
glutamine ThermoFisher 25030164
Hemocytometer Marien Feld Neubauer-Improved Bright line
Human serum albumin Sigma A1653
inverted microscope Fisher brand 11-350-119
microcentrifuge Beckman Coulter Microfuge 20
microcentrifuge tube, 1.5 mL USA Scientific 1615-5500
microwell culture plate Stemcell technologies 34411 Aggrewell 400, 24 well
motor-driven pestle GAMUT #399X644
non-tissue culture treated dish, 10 cm Fisher Scientific FB0875713
PBS ThermoFisher 14190250
Penicillin-streptomycin ThermoFisher 10378016
Petri dish, 35 mm Celltreat 229638
pipette, 5 mL DOT Scientific, 667205B
pipette, 8-channel VWR #613-5253
pipette, 10 mL VWR 667210B
pipette, P10 Denville UEZ-P-10
pipette, P200 Denville UEZ-P-200
pipette, P1000 Denville UEZ-P-1000
proteolytic and collagenolytic enzyme mixture Sigma A6965 Accutase
reagent reservoir, 50 mL VWR 89094-680
reversible strainer, 37 micrometer Stemcell technologies 27251
swing bucket plate centrifuge Beckman Coulter Allegra X-14R
swing bucket rotor Beckman Coulter SX4750A
tuberculin syringe, 1 mL BD 309659
ultra low attachment microplate, 96 well Corning 4515

References

  1. Chen, C., Cohrs, C. M., Stertmann, J., Bozsak, R., Speier, S. Human beta cell mass and function in diabetes: Recent advances in knowledge and technologies to understand disease pathogenesis. Molecular Metabolism. 6 (9), 943-957 (2017).
  2. Hong, H., Jo, J., Sin, S. J. Stable and flexible system for glucose homeostasis. Physiological Review E covering statistical, nonlinear, biological, and soft matter physic. 88 (3), 032711 (2013).
  3. Cryer, P. E. Minireview: Glucagon in the pathogenesis of hypoglycemia and hyperglycemia in diabetes. Endocrinology. 153 (3), 1039-1048 (2012).
  4. Arrojo e Drigo, R., et al. New insights into the architecture of the islet of Langerhans: a focused cross-species assessment. Diabetologia. 58 (10), 2218-2228 (2015).
  5. Harata, M., et al. Delivery of shRNA via lentivirus in human pseudoislets provides a model to test dynamic regulation of insulin secretion and gene function in human islets. Physiological Reports. 6 (20), e13907 (2018).
  6. Barbu, A. R., Akusjarvi, G., Welsh, N. Adenoviral-mediated transduction of human pancreatic islets: importance of adenoviral genome for cell viability and association with a deficient antiviral response. Endocrinology. 146 (5), 2406-2414 (2005).
  7. Hughes, A., et al. Gene therapy to improve pancreatic islet transplantation for Type 1 diabetes mellitus. Current Diabetes Reviews. 6 (5), 274-284 (2010).
  8. Jimenez-Moreno, C. M., et al. A Simple High Efficiency Intra-Islet Transduction Protocol Using Lentiviral Vectors. Current Gene Therapy. 15 (4), 436-446 (2015).
  9. Bonora, E., et al. Prevalence and correlates of post-prandial hyperglycaemia in a large sample of patients with type 2 diabetes mellitus. Diabetologia. 49 (5), 846-854 (2006).
  10. Halban, P. A., Powers, S. L., George, K. L., Bonner-Weir, S. Spontaneous reassociation of dispersed adult rat pancreatic islet cells into aggregates with three-dimensional architecture typical of native islets. Diabetes. 36 (7), 783-790 (1987).
  11. Yu, Y., et al. Bioengineered human pseudoislets form efficiently from donated tissue, compare favourably with native islets in vitro and restore normoglycaemia in mice. Diabetologia. 61 (9), 2016-2029 (2018).
  12. Zuellig, R. A., et al. Improved physiological properties of gravity-enforced reassembled rat and human pancreatic pseudo-islets. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (1), 109-120 (2017).
  13. Caton, D., et al. Lentivirus-mediated transduction of connexin cDNAs shows level- and isoform-specific alterations in insulin secretion of primary pancreatic beta-cells. Journal of Cell Science. 116 (Pt 11), 2285-2294 (2003).
  14. Arda, H. E., et al. Age-Dependent Pancreatic Gene Regulation Reveals Mechanisms Governing Human beta Cell Function. Cell Metabolism. 23 (5), 909-920 (2016).
  15. Peiris, H., et al. Discovering human diabetes-risk gene function with genetics and physiological assays. Nature Communications. 9 (1), 3855 (2018).
  16. Schlimgen, R., et al. Risks Associated With Lentiviral Vector Exposures and Prevention Strategies. Journal of Occupational and Environmental Medicine. 58 (12), 1159-1166 (2016).
  17. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  18. Li, N., et al. Engineering islet for improved performance by optimized reaggregation in alginate gel beads. Biotechnology and Applied Biochemistry. 64 (3), 400-405 (2017).
  19. Ramachandran, K., Peng, X., Bokvist, K., Stehno-Bittel, L. Assessment of re-aggregated human pancreatic islets for secondary drug screening. British Journal of Pharmacology. 171 (12), 3010-3022 (2014).
  20. Hilderink, J., et al. Controlled aggregation of primary human pancreatic islet cells leads to glucose-responsive pseudoislets comparable to native islets. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 19 (8), 1836-1846 (2015).
  21. Saunders, D. C., et al. Ectonucleoside Triphosphate Diphosphohydrolase-3 Antibody Targets Adult Human Pancreatic beta Cells for In Vitro and In Vivo Analysis. Cell Metabolism. (18), (2018).
  22. Reissaus, C. A., Piston, D. W. Reestablishment of Glucose Inhibition of Glucagon Secretion in Small Pseudoislets. Diabetes. 66 (4), 960-969 (2017).

Play Video

Cite This Article
Liu, S., Harata, M., Promes, J. A., Burand, A. J., Ankrum, J. A., Imai, Y. Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates. J. Vis. Exp. (147), e59578, doi:10.3791/59578 (2019).

View Video