Dit protocol wordt gebruikt om enkelvoudige atriale cardiomyocyten van het volwassen muis hart te isoleren met behulp van een Brok digestie benadering. Deze aanpak wordt gebruikt om te isoleren van rechts of links atriale myocyten die kunnen worden gebruikt voor het karakteriseren van Atrium myocyten elektrofysiologie in Patch-clamp studies.
De elektrofysiologische eigenschappen van atriale myocyten zijn belangrijk voor de algehele hartfunctie. Veranderingen in de onderliggende Ionische stromingen die verantwoordelijk zijn voor het actie potentieel kunnen pro-aritmische substraten veroorzaken die het gevolg zijn van aritmie, zoals Boezemfibrillatie, die in vele aandoeningen en ziektetoestanden zeer gangbaar zijn. Het isoleren van volwassen muis atriale hartspier voor gebruik in Patch-clamp experimenten heeft onze kennis en het begrip van de cellulaire elektrofysiologie in het gezonde atriale myocardium en in de setting van atriale pathofysiologie sterk gevorderd. Bovendien hebben studies met behulp van genetische Muismodellen de rol van een groot aantal eiwitten bij het reguleren van atriale elektrofysiologie opgehelderd. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor de isolatie van cardiomyocyten van de atriale aanhangsels van volwassen muizen met behulp van een combinatie van enzymatische spijsvertering en mechanische dissociatie van deze weefsels. Deze aanpak levert consequent en betrouwbaar geïsoleerde atriale cardiomyocyten op die vervolgens kunnen worden gebruikt om cellulaire elektrofysiologie te karakteriseren door het meten van actie potentialen en Ionische stromingen in Patch-clamp experimenten onder een aantal experimentele Voorwaarden.
De atria, die de dunne ommuurde, lage drukkamers van het hart die bloed ontvangen van de superieure en inferieure Vena ader evenals de pulmonale aderen, zijn integraal in de normale cardiale fysiologie. Net als andere delen van het hart, de atria bevatten een aantal celtypen, met inbegrip van cardiomyocyten, fibroblasten, endotheel cellen, vasculaire gladde spiercellen, en anderen. Atriale myocyten zijn elektrisch prikkelbaar cellen die een essentiële rol spelen in de geleiding van elektrische signalen door het hart, waardoor een goede atriale contractie wordt verzekerd tijdens elke hartslag1. Elektrische disfunctie in de Atria kan leiden tot een aantal atriale specifieke aritmie zoals atriale flutter en boezemfibrilleren2,3. Deze zijn zeer gangbaar, maar slecht begrepen, atriale aritmie die tot ernstige morbiditeit en sterfte leiden. Atriumfibrillatie kan optreden in samenwerking met genetische mutaties, in associatie met veroudering of in de setting van verworven vormen van hartziekte, waaronder hypertensie, hartfalen en diabetes2,4,5 ,6. Deze voorwaarden kunnen de elektrische eigenschappen van atriale myocyten wijzigen die een substraat kunnen creëren dat de prevalentie van aritmogenese1,2verhoogt.
Normale elektrische functie in de atria, evenals atriale aritmogenese, zijn belangrijk beïnvloed door de morfologie van de actiepotentiaal (AP) geproduceerd in atriale myocyten. De atriale AP wordt gegenereerd uit de activiteit van een aantal Ionische stromingen, met inbegrip van de natrium stroom (Ina, uitgevoerd door NaV1,5 kanalen), de l-type calcium stroom (iCA, L, uitgevoerd door cav1,2 en CAv1,3 kanalen ), en verschillende kaliumstromingen, waaronder de ultrasnelle vertraagde gelijkrichter kalium stroom (IKur, uitgevoerd door kv1,5 kanalen), de voorbijgaande uiterlijke kalium stroom (i세스, uitgevoerd door kv4,2 en kv4,3 ), een steady state kalium stroom (iKSS, gedragen door kV2,1 kanalen), en de actieve gelijkrichter kalium stroom (iK1, gedragen door kIR2,1 kanalen)1,7, 8. Hoewel ze niet spelen een belangrijke rol in de muis atria, de snelle en langzame onderdelen van de vertraagde gelijkrichter K+ stroom (iKR en ikKS) ook bijdragen aan AP repolarisatie in sommige soorten7. Veranderingen in een of meer van deze Ionische stromingen kunnen de elektrische eigenschappen van atriale myocyten significant veranderen, wat kan leiden tot atriale aritmie. Bijvoorbeeld, een verlaging van Ina kan vertragen geleiding snelheid over de atria door het verminderen van de snelheid van de AP-neerwaartse. Aan de andere kant kan een afname van de repolariserende kaliumstromen of een toename van ICA, L of de late ina leiden tot de ontwikkeling van afterdepolarisaties die spontane activiteit in de atria1kunnen triggeren, 2,9.
Het is belangrijk om te erkennen dat er verschillen in AP-morfologie zijn in verschillende delen van het atriale myocardium die waarschijnlijk te wijten zijn aan verschillen in de uitdrukking of regulering van deze onderliggende ionenkanalen. Verschillen in AP-duur tussen de rechter-en linker atria in verband met verschillen in Itot de huidige dichtheid zijn bijvoorbeeld goed beschreven10,11,12,13. Ook hebben we onlangs aangetoond dat er verschillende patronen van elektrische remodellering in de rechter en linker atria van muizen met chronische hypertensie6,14. De rechter atriale posterieure muur bevat ook het sinoatriale knooppunt, dat zijn eigen kenmerkende patronen van AP-morfologie en vuur patronen heeft15. De afzonderlijke eigenschappen van myocyten in elk van deze verschillende delen van de atria kunnen in detail worden onderzocht met behulp van geïsoleerde myocyten uit elk van deze regio’s.
Er zijn verschillende benaderingen die kunnen worden gebruikt om Atrium myocytes voor patch-klem elektrofysiologie studies16isoleren. Een mogelijkheid is het gebruik van een retrograde perfusie benadering waarbij het hart via de aorta wordt gekandeerd voor de levering van enzymen. Hoewel dit een levensvatbare aanpak is, kan het variabiliteit in atriale myocyten kwaliteit produceren als gevolg van inconsistenties in de perfusie van de atria. We hebben een ‘ Brok ‘ digestie benadering aangenomen voor de isolatie van atriale myocyten die de noodzaak van retrograde perfusie van het hart elimineert. Onze aanpak maakt gebruik van een combinatie van enzymatische spijsvertering en mechanische dissociatie van atriale weefsel dat consistent en betrouwbaar grote aantallen geïsoleerde atriale myocyten oplevert die geschikt zijn voor Patch-clamp studies. Hoewel we hier onze aanpak beschrijven met behulp van atriaal aanhangsel weefsel, kan de aanpak worden gebruikt in elke regio van het atriale myocardium (d.w.z. rechts of links atriale aanhangsels, vrije wanden, posterieure wanden) die de onderzoeker kiest. Deze aanpak is ideaal voor studies van atriale myocyten elektrofysiologie bij genetisch gemodificeerde muizen, in muizen modellen van hart-en vaatziekten, of voor het bestuderen van de effecten van farmacologische verbindingen5,6,17 , 18 , 19.
Ons lab gebruikt dit protocol routinematig om muis atriale myocyten te isoleren voor gebruik in Patch-clamp experimenten om de effecten van verschillende vormen van hart-en vaatziekten, genetische mutaties of farmacologische verbindingen op atriale myocyten te onderzoeken Elektrofysiologie. Hoewel zeer reproduceerbaar, is de kwaliteit van de gegevens verkregen uit de geïsoleerde atriale myocyten afhankelijk van de kwaliteit van de isolatie. Bovendien zal herintroductie van calcium na de atriale myocyten isolatie resulteren in celdood voor een populatie van geïsoleerde myocyten als gevolg van de calcium paradox16. Dienovereenkomstig, isoleren van levensvatbare, kwalitatief hoogwaardige atriale myocyten met behulp van deze aanpak vereist praktijk en optimalisatie op meerdere punten in de isolatie. Eenmaal geoptimaliseerd, wordt geschat dat tussen 70-90% van de totale atriale myocyten die met deze benadering worden geïsoleerd, zowel calcium tolerant als staafvormig zal zijn. De stappen die de meeste praktijk en optimalisatie vereisen, worden hieronder besproken.
De snelheid en efficiëntie van de dissectie zullen downstream effecten hebben op de kwaliteit van de geïsoleerde cellen. Het is belangrijk om de tijd te nemen om ervoor te zorgen dat al het bloed uit het atriale weefsel wordt verwijderd en dat weefsel stroken worden gesneden in een vergelijkbare grootte. Het moet ongeveer 5 minuten duren om het bovendeel van de atriale te verwijderen, het weefsel in stroken te knippen en de weefsel stroken in de eerste buis van gemodificeerde Tyrode pH 6,9-oplossing over te brengen. Echter, als deze stap duurt te lang, de kwaliteit van het weefsel kan worden aangetast.
Het is ook belangrijk dat weefsel stroken worden gesneden tot een uniforme grootte binnen een isolement en tussen harten. Als weefsel stroken te groot of te klein zijn, of als ze niet uniform zijn binnen een isolatie, kan dit problemen veroorzaken bij zowel enzymatische spijsvertering als trituratie. Dit komt omdat kleine stroken meer grondig worden verteerd en grote strips onder verteerd zullen worden. Het is even belangrijk om rekening te houden met het genotype en de ziekte-instelling die wordt bestudeerd, aangezien de grootte van het aanhangsel van de boezem kan variëren tussen dieren. Hypertrofische harten hebben bijvoorbeeld grotere atriale aanhangsels in vergelijking met gezonde harten, en daarom kan de experimenteerder meer stroken in hypertrofische harten snijden in vergelijking met normale grootte harten. Dienovereenkomstig zal het optimaliseren van de grootte van de gesneden weefsel stroken en het toepassen van deze afmetingen op elk afzonderlijk atriale aanhangsel de reproduceerbaarheid van myocyten isolaties tussen experimentele omstandigheden aanzienlijk verbeteren.
Het delicate evenwicht tussen de enzymatische spijsvertering en mechanische dissociatie is de sleutel tot een succesvolle atriale myocyten isolatie met behulp van dit protocol. Als weefsel niet voldoende wordt gezwenld tijdens de enzymatische vertering, zullen de afzonderlijke weefsel stroken de neiging hebben om samen te klonteren en aan elkaar te kleven, wat de effectiviteit van de enzymatische spijsvertering zal beperken. Als het te vaak of krachtig wordt geagiteerd, kan dit het atriale weefsel beschadigen, wat zal resulteren in het isoleren van niet-levensvatbare cellen. Mechanische dissociatie van geïsoleerde atriale myocyten uit weefsel stroken tijdens de trituratie is de meest kritieke stap om te oefenen en te optimaliseren met behulp van deze aanpak om atriale myocyten te isoleren. Als de trituratie te zacht is, zal de celopbrengst laag zijn. Aan de andere kant, als de trituratie te streng is, zal een overvloed aan niet-levensvatbare myocyten worden geïsoleerd, en de kwaliteit van de gegevens die worden verkregen tijdens patch-klem experimenten zullen in gevaar worden gebracht. Bovendien kan de samenstelling van de atria invloed hebben op de isolatie. Bijvoorbeeld, als weefsel fibrotische, de enzymatische spijsvertering en de trituratie stappen mogelijk moeten worden gewijzigd. Het is daarom belangrijk om de tijd te nemen om de vaardigheden te ontwikkelen die nodig zijn om hoge kwaliteit cellen te verkrijgen tijdens de trituratie die gebruikt kan worden voor Patch-clamp experimenten.
Zoals bij alle experimentele technieken zijn er beperkingen. Deze techniek vereist praktijk om levensvatbare, hoge kwaliteit myocyten te isoleren, wat weer invloed zal hebben op de haalbaarheid van eventuele experimenten die met deze myocyten worden uitgevoerd. Deze aanpak is ook Terminal en Atrium myocyten geïsoleerd met behulp van deze aanpak kan worden gebruikt op de dag van de isolatie alleen. Ons lab gebruikt de cellen binnen 6-7 h van isolatie.
Deze aanpak van het isoleren van atriale hartspier heeft verschillende toepassingen. Deze benadering kan bijvoorbeeld worden aangepast om atriale myocyten (evenals cardiale fibroblasten) te isoleren van andere soorten, waaronder biopsies van menselijk Atrium weefsel. Bovendien, een voordeel voor het gebruik van deze Chunk methode voor atriale myocyten isolatie (in tegenstelling tot retrograde perfusie van het hart) is dat het kan worden gewijzigd om te isoleren van hartspier uit andere gebieden van het hart, zoals de sinoatriale knooppunt of andere specifieke regio’s van het atriale myocardium, of omvatten het gehele Supraventriculaire gebied van het hart. Ons laboratorium gebruikt atriale cardiomyocyten voor Patch-clamp experimenten om actie potentialen en Ionische stromingen te meten, hoewel deze aanpak niet beperkt hoeft te blijven tot deze techniek. Geïsoleerde myocyten kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt om veranderingen in calcium Transiënten en contractiliteit in verschillende experimentele instellingen te onderzoeken. Atriale cardiomyocyten kunnen ook worden gebruikt in immunofluorescentie studies om de locatie van eiwitten of structuren van belang te bestuderen. Dienovereenkomstig is deze aanpak zeer veelzijdig met veel mogelijke toepassingen.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk wordt ondersteund door de exploitatiesubsidies van de Canadese instituten voor gezondheidsonderzoek (MOP 93718, 142486) en het hart en beroerte Foundation van Canada aan R.A. Rose. H.J. Jansen is de winnaar van een Killam Postdoctoral Fellowship.
1, 2-Bis(2-Aminophenoxy)ethane-N, N, N', N'-tetraacetic acid 98% | Sigma | A4926-1G | |
Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate BioXtra, > 99%, from microbial | Sigma | A7699-1G | |
Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt > 95%, bacterial | Sigma | A9187-1G | |
Amphocetericin B from Streptomyces sp. ~80% (HPLC), powder | Sigma | A4888-500 MG | |
Bovine serum albumin | Sigma | A3059-50G | |
Calcium chloride dihydrate | Sigma | 223506-500G | |
Cesium chloride ReagentPlus, 99.9% | Sigma | 289329-100G | |
Cesium hydroxide monohydrate > 99.5% trace metals basis | Sigma | 562505-1KG | |
Collagenase Type 2 | Worthington Biochemical Corporation | LS004176 | |
Creatine anhydrous | Sigma | C0780 | |
D-(+)-Glucose | Sigma | G7021-1KG | |
DL-Aspartic acid potassium salt | Sigma | A2025-100G | |
Elastase suspension | Worthington Biochemical Corporation | LS002279 | |
Ethylene glycol-bis(2-amino-ethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid >97.0% | Sigma | E4378-25G | |
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate > 95% (HPLC), powder | Sigma | G8877-250MG | |
Heparin 10 000 USP units/10mL | SANDOZ | 10750 | |
HEPES > 99.5% (titration) | Sigma | H3375-500G | |
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate > 99% (HPLC), powder | Sigma | G1501-500G | |
Magnesium sulfate | Sigma | M2643-500G | |
Nifedipine > 98% (HPLC), powder | Sigma | N7634-1G | |
Phosphocreatine disodium salt hydrate enzymatic, approx 98% | Sigma | P7936-5G | |
Potassium chloride ACS reagent, 99.0-100.5% | Sigma | P3911-500G | |
Potassium hydroxide | EM Science | PX1480-1 | |
Potassium phosphate monobasic | EMD | PX1565-1 | |
Protease from Streptomyces griseus, type XIV, >3.5 units/mg solid, powder | Sigma | P5147-1G | |
Sodium chloride ACS reagent, > 99.0% | Sigma | S9888-2.5KG | |
Sodium hydroxide, pellets, 97+%, A.C.S. reagent | Sigma | 221465-500G | |
Sylgard 184 silicone elastomer kit | World Precision Instruments Inc | SYLG184 | |
Taurine | Sigma | T0625-100G | |
Tetraethylammonium chloride > 98% (titration) | Sigma | T2265-100G |