Questo protocollo viene utilizzato per isolare i cardiomiociti atriale singoli dal cuore adulto del topo utilizzando un approccio di digestione a blocchi. Questo approccio viene utilizzato per isolare i miociti atriale destro o sinistro che possono essere utilizzati per caratterizzare l’elettrofisiologia dei miociti atriale negli studi patch-clamp.
Le proprietà elettrofisiologiche dei miociti atriale influenzano in modo importante la funzione cardiaca generale. Le alterazioni delle correnti ioniche sottostanti responsabili del potenziale di azione possono causare substrati pro-aritmici che sono alla base di aritmie, come la fibrillazione atriale, che sono altamente prevalenti in molte condizioni e stati di malattia. Isolare i cardiomiociti atriale per gli adulti per l’uso negli esperimenti di patch-clamp ha notevolmente avanzato la nostra conoscenza e comprensione dell’elettrofisiologia cellulare nel miocardio atriale sano e nell’impostazione della fiofilologia atriale. Inoltre, gli studi condotti su modelli murini genetici hanno chiarito il ruolo di una vasta gamma di proteine nella regolazione dell’elettrofisiologia atriale. Qui forniamo un protocollo dettagliato per l’isolamento dei cardiomiociti dalle appendici atriale dei topi adulti utilizzando una combinazione di digestione enzimatica e dissociazione meccanica di questi tessuti. Questo approccio produce in modo coerente e affidabile cardiomiociti atriale isolati che possono essere utilizzati per caratterizzare l’elettrofisiologia cellulare misurando i potenziali d’azione e le correnti ioniche negli esperimenti patch-clamp sotto una serie di esperimenti sperimentali Condizioni.
Gli atri, che sono le sottili camere murali e a bassa pressione del cuore che ricevono sangue dalla vena cava superiore e inferiore e dalle vene polmonari, sono parte integrante della normale fisiologia cardiaca. Come altre regioni del cuore, gli atri contengono una serie di tipi di cellule, tra cui cardiomiociti, fibroblasti, cellule endoteliali, cellule muscolari lisce vascolari, e altri. I miociti atriale sono cellule elettricamente eccitabili che svolgono un ruolo essenziale nella conduzione dei segnali elettrici attraverso il cuore, garantendo così una corretta contrazione atriale durante ogni battito cardiaco1. La disfunzione elettrica negli atri può portare a una serie di aritmie specifiche atriale come flutter atriale e fibrillazione atriale2,3. Queste sono aritmie atriale molto diffuse, ma poco conosciute, che portano a morbilità e mortalità significative. La fibrillazione atriale può verificarsi in associazione con mutazioni genetiche, in associazione con l’invecchiamento o nell’impostazione di forme acquisite di malattie cardiache, tra cui ipertensione, insufficienza cardiaca e diabete2,4,5 ,6. Queste condizioni possono alterare le proprietà elettriche dei miociti atriale che possono creare un substrato che aumenta la prevalenza di aritmogenesi1,2.
La normale funzione elettrica negli atri, così come l’aritmogenesi atriale, sono influenzati in modo importante dalla morfologia del potenziale di azione (AP) prodotta nei miociti atriale. L’AP atriale è generato dall’attività di una serie di correnti ioniche, tra cui la corrente di sodio (INa, trasportata dai canali NaV1.5), la corrente di calcio di tipo L (ICa,L, trasportata dai canali Cav1.2 e CaV1.3 ), e diverse correnti di potassio tra cui la corrente di potassio di rettificatore ritardato ultrarapido (IKur, trasportato da KV1.5 canali), la corrente transitoria di potassio verso l’esterno (Ia, trasportato da KV4.2 e KV4.3 canali), una corrente di potassio a stato costante (IKss, trasportata da canali KV2.1) e la corrente di potassio rettificatore verso l’interno (IK1, trasportata da Kir2.1 canali)1,7, 8. Anche se non svolgono un ruolo importante negli atri del topo, i componenti rapidi e lenti del rettificatore ritardato K– corrente (IKr e IKs) contribuiscono anche alla ripolarizzazione AP in alcune specie7. Le alterazioni in una o più di queste correnti ioniche possono alterare significativamente le proprietà elettriche dei miociti atriale, che possono portare ad aritmie atriale. Ad esempio, una riduzione di INa può rallentare la velocità di conduzione attraverso gli atri riducendo la velocità di upstroke AP. D’altra parte, una riduzione delle correnti di potassio ripolarizzanti o un aumento di ICa,L o la fine INa può provocare lo sviluppo di afterdepolarizations che possono innescare l’attività spontanea negli atri1, 2,9.
È importante riconoscere che ci sono differenze nella morfologia AP in diverse parti del miocardio atriale che sono probabilmente dovute a differenze nell’espressione o nella regolazione di questi canali ionici sottostanti. Ad esempio, le differenze nella durata AP tra gli atri destro e sinistro in associazione con le differenze tra Ie densità corrente sono state ben descritte10,11,12,13. Inoltre, abbiamo recentemente dimostrato che ci sono modelli distinti di rimodellamento elettrico nell’atria destra e sinistra di topi con ipertensione cronica6,14. La parete posteriore atriale destra contiene anche il nodo sinoatriale, che ha i suoi modelli distinti di morfologia AP e modelli di cottura15. Le proprietà distinte dei miociti in ciascuna di queste diverse parti degli atri possono essere studiate in dettaglio utilizzando miociti isolati da ciascuna di queste regioni.
Ci sono diversi approcci che possono essere utilizzati per isolare i miociti atriale per studi di elettrofisiologia patch-clamp16. Una possibilità è quella di utilizzare un approccio retrogrado perfusione in cui il cuore è cannulato attraverso l’aorta per la consegna di enzimi. Mentre questo è un approccio praticabile, può produrre variabilità nella qualità dei miociti atriale a causa di incongruenze nella perfusione degli atri. Abbiamo adottato un approccio di digestione “chunk” per l’isolamento dei miociti atriale che elimina la necessità di perfusione retrograda del cuore. Il nostro approccio utilizza una combinazione di digestione enzimatica e dissociazione meccanica del tessuto atriale che produce in modo coerente e affidabile un gran numero di miociti atriale isolati che sono adatti per gli studi patch-clamp. Mentre descriviamo il nostro approccio qui utilizzando il tessuto di appendice atriale, l’approccio può essere utilizzato su qualsiasi regione del miocardio atriale (cioè, appendici atriale destra o sinistra, pareti libere, pareti posteriori) che l’investigatore sceglie. Questo approccio è ideale per studi di elettrofisiologia atriale miocite in topi geneticamente modificati, in modelli murini di malattie cardiovascolari, o per studiare gli effetti dei composti farmacologici5,6,17 , 18 mi lato , 19.
Il nostro laboratorio utilizza abitualmente questo protocollo per isolare i miociti atriale dei topi da utilizzare in esperimenti patch-clamp al fine di studiare gli effetti di diverse forme di malattie cardiovascolari, mutazioni genetiche o composti farmacologici su miociti atriale Elettrofisiologia. Anche se altamente riproducibile, la qualità dei dati ottenuti dai miociti atriale isolati dipende dalla qualità dell’isolamento. Inoltre, la reintroduzione del calcio dopo l’isolamento atriale dei mivociti comporterà la morte cellulare per una popolazione di miociti isolati a causa del paradosso del calcio16. Di conseguenza, isolare i miociti atriale vitali e di alta qualità utilizzando questo approccio richiede pratica e ottimizzazione in più punti durante l’isolamento. Una volta ottimizzato, si stima che tra il 70-90% dei miociti atriale totali isolati utilizzando questo approccio sarà sia tollerante al calcio che a forma di asta. I passaggi che richiedono la massima pratica e ottimizzazione sono descritti di seguito.
La velocità e l’efficienza della dissezione avranno effetti a valle sulla qualità delle cellule isolate. È importante prendere tempo per garantire che tutto il sangue viene rimosso dal tessuto atriale e che le strisce di tessuto siano tagliate a dimensioni simili. Dovrebbe richiedere circa 5 min per rimuovere l’appendice atriale, tagliare il tessuto a strisce e trasferire le strisce di tessuto nel primo tubo della soluzione pH 6.9 di Tyrode modificata. Tuttavia, se questo passaggio richiede troppo tempo, la qualità del tessuto può essere compromessa.
È anche importante che le strisce di tessuto siano tagliate a una dimensione uniforme all’interno di un isolamento e tra i cuori. Se le strisce di tessuto sono troppo grandi o troppo piccole, o se non sono uniformi all’interno di un isolamento, questo può causare problemi durante sia la digestione enzimatica che la curiosazione. Questo perché le piccole strisce saranno più accuratamente digerite e grandi strisce saranno sotto digerite. È altrettanto importante considerare che il genotipo e l’impostazione della malattia vengono studiati in quanto le dimensioni dell’appendice atriale possono variare tra gli animali. Ad esempio, i cuori ipertrofici hanno appendici atriale più grandi rispetto ai cuori sani, e quindi lo sperimentatore può tagliare più strisce nei cuori ipertrofici rispetto ai cuori di dimensioni normali. Di conseguenza, l’ottimizzazione delle dimensioni delle strisce di tessuto tagliato e l’applicazione di queste dimensioni a ogni singola appendice atriale migliorerà notevolmente la riproducibilità degli isolamenti dei miociti tra condizioni sperimentali.
Il delicato equilibrio tra la digestione enzimatica e la dissociazione meccanica è fondamentale per un riuscito isolamento da miocito atriale utilizzando questo protocollo. Se il tessuto non è adeguatamente vorticoso durante la digestione enzimatica le singole strisce di tessuto tenderanno ad aggregarsi e attaccarsi insieme, il che limiterà l’efficacia della digestione enzimatica. Se agitato troppo frequentemente o vigorosamente, questo può danneggiare il tessuto atriale, che si tradurrà nell’isolamento di cellule non vitali. La dissociazione meccanica dei miociti atriale isolati dalle strisce di tessuto durante la triturazione è il passo più critico per praticare e ottimizzare utilizzando questo approccio per isolare i miociti atriale. Se la triturazione è troppo delicata, la resa cellulare sarà bassa. D’altra parte, se la triturazione è troppo dura, allora un’abbondanza di miociti non vitali sarà isolata e la qualità dei dati ottenuti durante gli esperimenti di patch-clamp sarà compromessa. Inoltre, la composizione degli atri può influenzare l’isolamento. Ad esempio, se il tessuto è fibrotico, la digestione enzimatica e le fasi di triturazione potrebbero dover essere modificate. È quindi importante prendere il tempo per sviluppare le competenze necessarie per ottenere cellule di alta qualità durante la triturazione che possono essere utilizzate per esperimenti patch-clamp.
Come con tutte le tecniche sperimentali ci sono limitazioni. Questa tecnica richiede pratica per isolare riproducibilmente i miociti vitali e di alta qualità, che a loro volta influiranno sulla fattibilità di qualsiasi esperimento da eseguire utilizzando questi miociti. Questo approccio è anche terminale e i miociti atriale isolati utilizzando questo approccio possono essere utilizzati solo il giorno dell’isolamento. Il nostro laboratorio usa le cellule entro 6-7 h di isolamento.
Questo approccio di isolamento dei cardiomiociti atriale ha diverse applicazioni. Ad esempio, questo approccio può essere modificato per isolare i miociti atriale (così come i fibroblasti cardiaci) da altre specie, incluse le biopsie del tessuto atriale umano. Inoltre, un vantaggio dell’utilizzo di questo metodo a blocchi per l’isolamento dei miociti atriale (a differenza della perfusione retrograda del cuore) è che può essere modificato per isolare i cardiomiociti da altre regioni del cuore, come il nodo sinoatrial o altre regioni specifiche del miocardio atriale, o comprendono l’intera regione solficia del cuore. Il nostro laboratorio utilizza cardiomiociti atriale per esperimenti patch-clamp per misurare i potenziali d’azione e le correnti ioniche, anche se questo approccio non deve essere limitato a questa tecnica. Ad esempio, i miociti isolati possono essere utilizzati per studiare le alterazioni dei transitori di calcio e la contrattilità in una varietà di ambienti sperimentali. I cardiomiociti atriale possono essere utilizzati anche negli studi di immunofluorescenza per studiare la posizione di proteine o strutture di interesse. Di conseguenza, questo approccio è altamente versatile con molte possibili applicazioni.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è supportato dalle sovvenzioni operative dei Canadian Institutes of Health Research (MOP 93718, 142486) e della Heart and Stroke Foundation of Canada a R.A. Rose. H.J. Jansen è il destinatario di una killam Postdoctoral Fellowship.
1, 2-Bis(2-Aminophenoxy)ethane-N, N, N', N'-tetraacetic acid 98% | Sigma | A4926-1G | |
Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate BioXtra, > 99%, from microbial | Sigma | A7699-1G | |
Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt > 95%, bacterial | Sigma | A9187-1G | |
Amphocetericin B from Streptomyces sp. ~80% (HPLC), powder | Sigma | A4888-500 MG | |
Bovine serum albumin | Sigma | A3059-50G | |
Calcium chloride dihydrate | Sigma | 223506-500G | |
Cesium chloride ReagentPlus, 99.9% | Sigma | 289329-100G | |
Cesium hydroxide monohydrate > 99.5% trace metals basis | Sigma | 562505-1KG | |
Collagenase Type 2 | Worthington Biochemical Corporation | LS004176 | |
Creatine anhydrous | Sigma | C0780 | |
D-(+)-Glucose | Sigma | G7021-1KG | |
DL-Aspartic acid potassium salt | Sigma | A2025-100G | |
Elastase suspension | Worthington Biochemical Corporation | LS002279 | |
Ethylene glycol-bis(2-amino-ethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid >97.0% | Sigma | E4378-25G | |
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate > 95% (HPLC), powder | Sigma | G8877-250MG | |
Heparin 10 000 USP units/10mL | SANDOZ | 10750 | |
HEPES > 99.5% (titration) | Sigma | H3375-500G | |
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate > 99% (HPLC), powder | Sigma | G1501-500G | |
Magnesium sulfate | Sigma | M2643-500G | |
Nifedipine > 98% (HPLC), powder | Sigma | N7634-1G | |
Phosphocreatine disodium salt hydrate enzymatic, approx 98% | Sigma | P7936-5G | |
Potassium chloride ACS reagent, 99.0-100.5% | Sigma | P3911-500G | |
Potassium hydroxide | EM Science | PX1480-1 | |
Potassium phosphate monobasic | EMD | PX1565-1 | |
Protease from Streptomyces griseus, type XIV, >3.5 units/mg solid, powder | Sigma | P5147-1G | |
Sodium chloride ACS reagent, > 99.0% | Sigma | S9888-2.5KG | |
Sodium hydroxide, pellets, 97+%, A.C.S. reagent | Sigma | 221465-500G | |
Sylgard 184 silicone elastomer kit | World Precision Instruments Inc | SYLG184 | |
Taurine | Sigma | T0625-100G | |
Tetraethylammonium chloride > 98% (titration) | Sigma | T2265-100G |