Dışa bakıyor: Siyanobacterial serbest karbonhidrat polimerleri ve proteinleri Izolasyonu
Summary
Burada, siyanobakteryal serbest karbonhidrat polimerlerinin izolasyonu ve exoproteomlarının izolasyonu için protokoller açıklanmıştır. Her iki prosedür de, daha fazla analiz veya uygulama için kullanılabilecek yüksek saflık derecelerine sahip Polimerler veya proteinleri elde etmek için önemli adımları somutlaştırmak. Ayrıca, belirli kullanıcı ihtiyaçlarına göre kolayca adapte edilebilir.
Abstract
Siyanobacteria, heteropolizakkaritler ve proteinler gibi, geniş bir yelpazede biomolekülleri hücre içi ortama aktif olarak salgılasabilir. Bu Biomoleküllerin tanımlanması ve karakterize edilmesi, salgısı yolları hakkında bilgi geliştirebilir ve onları manipüle etmenize yardımcı olabilir. Ayrıca, bu biyomoleküllerin bazıları da biyoteknolojik uygulamalar açısından ilginç. Burada açıklanan cyanobacterial serbest karbonhidrat polimerleri ve proteinlerin kolay ve hızlı yalıtım için iki protokol vardır. Yayımlanan karbonhidrat polimerlerinin yalıtım yöntemi, organik çözücüler kullanarak sulu çözümlerde polisakkaritlerin geleneksel yağış tekniklerini temel alır. Bu yöntem polimer özelliklerini korur ve aynı anda hücre enkaz ve kültür ortamından kirleticilerin varlığını önler. Sürecin sonunda, liyofilize polimer kullanılmak üzere hazır veya karakterize veya son amaçlanan kullanıma bağlı olarak, arıtma daha fazla tur maruz kalabilirler. Cyanobacterial exoproteomun izolasyonu ile ilgili olarak, teknik, büyük kirleticilerin santrifüjleme ve filtrasyon ile kaldırılmasından sonra hücre içermeyen ortamın konsantrasyonuna dayanır. Bu strateji, membran taşıyıcıları veya dış membran veziküller üzerinden ekstrülüler ortama ulaşan proteinleri güvenilir bir şekilde yalıtmayı sağlar. Bu proteinler daha sonra standart kütle spektrometresi teknikleri kullanılarak tespit edilebilir. Burada sunulan protokoller sadece geniş bir siyanobacteria yelpazesine değil, aynı zamanda diğer bakteriyel suşların da uygulanabilmektedir. Ayrıca, bu prosedürler, ürünlerin son kullanımına, gerekli saflık derecesine ve bakteriyel gerilime göre kolayca uyarlanmış olabilir.
Introduction
Siyanobacteria, umut verici biyoteknolojik/biyomedikal uygulamalar ile doğal ürünlerin üretken kaynakları olarak yaygın olarak tanınır. Bu nedenle, siyanobakteryal salgılanma mekanizmaları ve ekstraksiyon/kurtarma yöntemlerinin optimizasyonu anlayışı, etkili mikrobiyal hücre fabrikaları olarak siyanobasitemi uygulamak için esastır.
Birçok siyanobacterial suşları, ağırlıklı olarak heteropolizakkaritler tarafından oluşturulan, hücre yüzeyine ilişkili kalan veya orta1‘ e serbest bırakılan, ekstrülüler polimerik maddeler (EPS) üretebilir. Bu serbest karbonhidrat polimerleri, diğer bakterilere kıyasla farklı özelliklere sahiptir, bu da onları geniş bir uygulama yelpazesi için uygun hale getiren (örn., antiviral2, immünostimulatuar3, antioksidan4, Metal-şelasyon5, Emulsifying6, ve ilaç teslim ajanlar7,8). Bu polimerlerin yalıtım metodolojisi büyük ölçüde sadece geliştirilmiş verim için değil, aynı zamanda artan saflık ve polimerin spesifik fiziksel özellikleri elde9katkıda bulunur. Polimerlerin izolasyonu için bu yöntemlerin büyük bir çoğunluğu, polimer güçlü anyonik doğa9,10nedeniyle kolayca gerçekleştirilen kültür ortamından yağış stratejileri güveniyor. Ayrıca, yağış adımda kullanılan çözücüler kaldırılması hızla buharlaşma ve/veya lyophilization ile elde edilebilir. Öngörülen uygulamaya bağlı olarak, trichloroasetik asit (TCA) tedavisi, filtrasyon veya boyut dışlama Kromatografi (SEC) dahil olmak üzere son ürünü terzi etmek için polimer yağışından sonra veya önce farklı adımlar birleştirilebilir. sütun arıtma10.
Cyanobacteria da membran taşıyıcıları (klasik)11 veya veziküller (klasik olmayan)12tarafından aracılı bağlı yollar aracılığıyla çeşitli proteinleri salgılayarak edebiliyoruz. Bu nedenle, siyanobakterial dış proteomun analizi, siyanobacterial protein salgısı mekanizmalarını anlamak/manipüle etmek ve bu proteinlerin belirli bir hücre dışı fonksiyonunu anlamak için önemli bir araçtır. Gizli proteinlerin bolluğu nispeten düşük olduğu için, exoproteomlerin güvenilir yalıtımı ve analizi, ekstrüler ortamın konsantrasyonunu gerektirir. Buna ek olarak, diğer fiziksel veya kimyasal adımlar (örneğin, santrifüjleme, filtrasyon veya protein yağış) elde edilen dış proteomun kalitesini optimize edebilir, protein içeriği13‘ ü zenginleştirebilir ve kirleticilerin varlığını önleyerek (örn. Pigmentler, karbonhidratlar, vb.) 14 , 15 veya numunelerde hücre içi proteinlerin üstünlüğü. Ancak, bu adımlardan bazıları da tespit edilebilir protein kümesini kısıtlayabilir, önyargılı bir analiz yol.
Bu çalışma, serbest karbonhidrat polimerleri ve siyanobacteria kültür medyadan exoproteomes izolasyonu için etkili protokoller açıklar. Bu protokoller, burada sunulan temel adımları korurken, çalışmanın belirli hedeflerine ve Kullanıcı ihtiyaçlarına kolayca adapte edilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bakteriyel salgılanma mekanizmalarını daha iyi anlamak ve serbest bırakılan ürünleri incelemek için, ekstraselüler bakteriyel ortamda mevcut olan Biomoleküllerin verimli yalıtımı ve analizini göstermek çok önemlidir (örneğin, serbest karbonhidrat polimerler ve proteinler).
Siyanobacterial ekstraküler karbonhidrat polimerleri, özellikle kompozisyon1‘ i oluşturan farklı monosakkaritlerin sayısı ve oranı nedeniyle son derece karmaşıktır. Bu poli…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Fundo Europeu de desenvolvimento Regional (FEDER) fonları tarafından rekabetçilik 2020-Operacional YARıŞMA ve uluslararasılaşma programı (POCı), Portekiz 2020 ve Portekiz fonları ile FCT-Fundação para a Ciência e aracılığıyla finanse edilmiştir. bir Tecnologia/Ministério da Ciência, Tecnologia e ensino proje çerçevesinde POCI-01-0145-FEDER-028779 ve Grant SFRH/BD/99715/2014 (CF) üstün.
Materials
| Dialysis membranes | Medicell Membranes Ltd | DTV.12000.07 | Visking Tubing Size 7, Dia 23.8 mm, Width 39-41 mm 30m Roll |
| Ethanol 96% | AGA – Álcool e Géneros Alimentares, S.A. | 4.000.02.02.00 | Fermentation ethyl alcohol 96% AGA |
| PES Filter 0.2 μm | Fisher Scientific, Lda | 15206869 | Syringe filter polystyrene 33MM 0.2µM STR |
| Amicon Ultra-15, Ultracel-3K | Merck Millipore Ltd. | UFC900324 | Centrifugal filters with a nominal molecular weight cut-off of 3 kDa |
| Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay | Fisher Scientific, Lda | 10741395 | Green-to-blue, precise, detergent-compatible assay reagent to measure total protein concentration |
| Brillant Blue G Colloidal Concentrate | Sigma Aldrich Química SL | B2025-1EA | Coomassie blue |
References
- Pereira, S., et al. Complexity of cyanobacterial exopolysaccharides: composition, structures, inducing factors and putative genes involved in their biosynthesis and assembly. FEMS Microbiology Reviews. 33 (5), 917-941 (2009).
- Kanekiyo, K., et al. Isolation of an Antiviral Polysaccharide, Nostoflan, from a Terrestrial Cyanobacterium, Nostoc flagelliforme. Journal of Natural Products. 68 (7), 1037-1041 (2005).
- Løbner, M., Walsted, A., Larsen, R., Bendtzen, K., Nielsen, C. H. Enhancement of human adaptive immune responses by administration of a high-molecular-weight polysaccharide extract from the cyanobacterium Arthrospira platensis. Journal of Medicinal Food. 11 (2), 313-322 (2008).
- Wang, H. B., Wu, S. J., Liu, D. Preparation of polysaccharides from cyanobacteria Nostoc commune and their antioxidant activities. Carbohydrate Polymers. 99, 553-555 (2014).
- Ozturk, S., Aslim, B., Suludere, Z., Tan, S. Metal removal of cyanobacterial exopolysaccharides by uronic acid content and monosaccharide composition. Carbohydrate Polymers. 101, 265-271 (2014).
- Han, P. P., et al. Emulsifying, flocculating, and physicochemical properties of exopolysaccharide produced by cyanobacterium Nostoc flagelliforme. Applied Biochemistry and Biotechnology. 172 (1), 36-49 (2014).
- Leite, J. P., et al. Cyanobacterium‐Derived Extracellular Carbohydrate Polymer for the Controlled Delivery of Functional Proteins. Macromolecular Bioscience. 17 (2), 1600206 (2017).
- Estevinho, B. N., et al. Application of a cyanobacterial extracellular polymeric substance in the microencapsulation of vitamin B12. Powder Technology. 343, 644-651 (2019).
- Klock, J. H., Wieland, A., Seifert, R., Michaelis, W. Extracellular polymeric substances (EPS) from cyanobacterial mats: characterisation and isolation method optimisation. Marine Biology. 152 (5), 1077-1085 (2007).
- Delattre, C., Pierre, G., Laroche, C., Michaud, P. Production, extraction and characterization of microalgal and cyanobacterial exopolysaccharides. Biotechnology Advances. 34 (7), 1159-1179 (2016).
- Costa, T. R., et al. Secretion systems in gram-negative bacteria: structural and mechanistic insights. Nature Reviews Microbiology. 13 (6), 343-359 (2015).
- Roier, S., Zingl, F. G., Cakar, F., Schild, S. Bacterial outer membrane vesicle biogenesis: a new mechanism and its implications. Microbial Cell. 3 (6), 257-259 (2016).
- Sergeyenko, T. V., Los, D. A. Identification of secreted proteins of the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803. FEMS Microbiology Letters. 193 (2), 213-216 (2000).
- Oliveira, P., et al. The versatile TolC-like Slr1270 in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Environmental Microbiology. 18 (2), 486-502 (2016).
- Flores, C., et al. The alternative sigma factor SigF is a key player in the control of secretion mechanisms in Synechocystis sp. PCC 6803. Environmental Microbiology. 21 (1), 343-359 (2018).
- Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., Smith, F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Analytical Chemistry. 28 (3), 350-356 (1956).
- Parikh, A., Madamwar, D. Partial characterization of extracellular polysaccharides from cyanobacteria. Bioresource Technology. 97 (15), 1822-1827 (2006).
- Rühmann, B., Schmid, J., Sieber, V. Methods to identify the unexplored diversity of microbial exopolysaccharides. Frontiers in Microbiology. 6, 565 (2015).
- Pathak, J., Rajneesh, R., Sonker, A. S., Kannaujiya, V. K., Sinha, R. P. Cyanobacterial extracellular polysaccharide sheath pigment, scytonemin: A novel multipurpose pharmacophore. Marine Glycobiology. , 343-358 (2016).
- Nguyen, A. T. B., et al. Performances of different protocols for exocellular polysaccharides extraction from milk acid gels: Application to yogurt. Food Chemistry. 239, 742-750 (2018).
- Jamshidian, H., Shojaosadati, S. A., Mousavi, S. M., Soudi, M. R., Vilaplana, F. Implications of recovery procedures on structural and rheological properties of schizophyllan produced from date syrup. International Journal of Biological Macromolecules. 105, 36-44 (2017).
- Couto, N., Schooling, S. R., Dutcher, J. R., Barber, J. Proteome profiles of outer membrane vesicles and extracellular matrix of Pseudomonas aeruginosa biofilms. Journal of Proteome Research. 14 (10), 4207-4222 (2015).
