खरोंच प्रवास परख और डोर्सल स्किनफ़ोल्ड चैंबर इन विट्रो के लिए और घाव हीलिंग के Vivo विश्लेषण में
Summary
यहाँ, हम प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट का उपयोग कर एक इन विट्रो खरोंच परख के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं और चूहों में एक विवो त्वचा घाव भरने परख के लिए। दोनों परख इन विट्रो में और विवो घाव भरने में आकलन करने के लिए सरल तरीके हैं।
Abstract
बिगड़ा cutaneous घाव भरने मधुमेह से पीड़ित रोगियों के लिए और बुजुर्ग लोगों के लिए एक प्रमुख चिंता का विषय है, और वहाँ एक प्रभावी उपचार के लिए एक की जरूरत है. त्वचा घाव भरने की प्रक्रिया में सुधार करने के लिए दवा उपचार के लिए नए लक्ष्य अणुओं की पहचान के लिए इन विट्रो और विवो दृष्टिकोणों में उपयुक्त आवश्यक हैं। हमने दो स्वतंत्र परखों में घाव भरने को प्रभावित करने के लिए एक संभावित लक्ष्य अणु के रूप में वोल्टेज-गेट्ड कैल्शियम चैनलों (कैवजेड 3) की $3 उपइकाई की पहचान की, अर्थात इन विट्रो खरोंच प्रवास परख और इन विवो पृष्ठीय त्वचा फ़ोल्ड चैम्बर मॉडल। प्राथमिक माउस भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट्स (एमईएफ) तीव्रता से जंगली प्रकार से अलग (WT) और Cav–3 कमी चूहों (Cav]3 KO) या फाइब्रोब्लास्ट्स तीव्रता से WT चूहों से अलग siRNA के साथ इलाज के लिए नीचे Cacnb3 जीन की अभिव्यक्ति को विनियमित , एन्कोडिंग Cav]3, का उपयोग किया गया. एक खरोंच एक confluent सेल monolayer पर लागू किया गया था और अंतर बंद करने के लिए निर्धारित समय अंक पर सूक्ष्म छवियों लेने के द्वारा पीछा किया गया था जब तक पलायन कोशिकाओं द्वारा अंतर की पूरी repopulation. इन छवियों का विश्लेषण किया गया, और सेल माइग्रेशन दर प्रत्येक शर्त के लिए निर्धारित किया गया था। एक में विवो परख में, हम WT और Cav$3 KO चूहों पर एक पृष्ठीय skinfold कक्ष प्रत्यारोपित, 2 मिमी व्यास की एक परिभाषित परिपत्र घाव लागू, एक गिलास coverslip के साथ घाव को कवर करने के लिए यह संक्रमण और desiccation से बचाने के लिए, और स्थूल घाव बंद नजर रखी समय के साथ. घाव बंद Cacnb3-जीन कमी चूहों में काफी तेजी से था. क्योंकि में विवो के परिणाम और इन विट्रो परख अच्छी तरह से सहसंबंधित, इन विट्रो परख में विवो घाव भरने मॉडल द्वारा इन विट्रो हिट मान्य करने से पहले उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए उपयोगी हो सकता है. क्या हम यहाँ जंगली प्रकार के लिए दिखाया गया है और Cav–3 कमी चूहों या कोशिकाओं को भी विशिष्ट अणुओं के लिए लागू हो सकता है केव के अलावा अन्य Cav $3.
Introduction
त्वचा की अखंडता को बहाल करने और संक्रमण से जीव की रक्षा करने के लिए त्वचा की चोट के तुरंत बाद त्वचा घाव भरने शुरू होता है। घाव भरने की प्रक्रिया चार ओवरलैपिंग चरणों के माध्यम से चला जाता है; स्कंदन, सूजन, नए ऊतक गठन, और ऊतक remodeling1. इन चरणों के दौरान सेल प्रवास महत्वपूर्ण है। भड़काऊ कोशिकाओं, प्रतिरक्षा कोशिकाओं, keratincytes, endothelial कोशिकाओं, और फाइब्रोब्लास्ट अलग अलग समय बिंदुओं पर सक्रिय कर रहे हैं और घाव क्षेत्र2पर आक्रमण। इन विट्रो और विवो में घाव भरने की जांच करने के तरीके न केवल अंतर्निहित तंत्र को समझने के लिए बल्कि नई दवाओं का परीक्षण करने और त्वचा घाव भरने में सुधार करने और तेजी लाने के लिए लक्ष्य वाली नई रणनीतियों को विकसित करने के लिए बहुत रुचि के हैं।
सेल माइग्रेशन की निगरानी और विश्लेषण करने के लिए, स्क्रैच माइग्रेशन परख का उपयोग किया जा सकता है. यह अक्सर इन विट्रो घाव भरने परख के रूप में जाना जाता है। इस विधि के लिए एक सेल संस्कृति सुविधा 3 की आवश्यकताहै। यह एक सरल प्रक्रिया है, वहाँ उच्च अंत उपकरणों की कोई जरूरत नहीं है और परख सबसे सेल जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं में किया जा सकता है. इस परख में, एक सेल मुक्त क्षेत्र एक confluent सेल मोनोलेयर के यांत्रिक विघटन के द्वारा बनाई गई है, अधिमानतः उपकला- या endothelial की तरह कोशिकाओं या फाइब्रोब्लास्ट्स. खरोंच के किनारे पर कोशिकाओं को बनाया अंतर repopulate करने के लिए माइग्रेट करेंगे. समय के साथ घटते सेल-मुक्त क्षेत्र का परिमाणीकरण प्रवास दर से मिलता-जुलता है और उस समय को इंगित करता है, जिसे कोशिकाओं को अंतराल को बंद करने की आवश्यकता होती है। इस उद्देश्य के लिए, जांचकर्ताओं या तो गंभीर रूप से अलग कोशिकाओं WT चूहों या चूहों ब्याज की एक जीन की कमी से उपयोग कर सकतेहैं 4, या विश्वसनीय सेल खजाने से उपलब्ध अमर कोशिकाओं. खरोंच परख औषधीय रूप से सक्रिय यौगिकों के प्रभाव या सेल प्रवास पर transfected CDNAs या siRNAs के प्रभाव का अध्ययन करने की अनुमति देता है.
विवो में, घाव भरने एक जटिल शारीरिक प्रक्रिया है, जिसमें केराटिनोसाइट्स, सूजन कोशिकाओं, फाइब्रोब्लास्ट्स, प्रतिरक्षा कोशिकाओं और एंडोथेलियल कोशिकाओं सहित विभिन्न प्रकार की आवश्यकता होती है ताकि त्वचा की शारीरिक अखंडता को तेजी से संभव 1 के रूप में बहाल किया जा सके . विवो घाव भरने के विभिन्न तरीकों का विकास किया गया है और इसका उपयोग पिछले5,6,7,8में किया गया है . इस लेख में वर्णित पृष्ठीय त्वचा का चर्खन पहले घाव भरने के लिए इस्तेमाल किया गया था. यह चूहों के लिए एक संशोधित पृष्ठीय skinfold कक्ष तैयारी के रूप में प्रयोग किया जाता है. संशोधित skinfold चैम्बर मॉडल कई फायदे हैं. 1) यह त्वचा संकुचन को कम करता है, जो घाव भरने की प्रक्रिया को देख रोकता है और चूहों में घाव की मरम्मत को प्रभावित कर सकता है। 2) यह कक्ष एक गिलास कवरस्लिप के साथ घाव को कवर करने, ऊतक संक्रमण और शुष्कता को कम करने का उपयोग करता है, जो उपचार प्रक्रिया में देरी कर सकता है। 3) रक्त प्रवाह और संवहनी सीधे नजर रखी जा सकती है. 4) यह घाव का इलाज करने और9,10के उपचार में तेजी लाने के लिए औषधीय रूप से सक्रिय यौगिकों और अभिकर्मकों के दोहराव सामयिक आवेदन की अनुमति देता है .
हमने दो स्वतंत्र प्रोटोकॉल का उपयोग करके त्वचा घाव भरने को प्रभावित करने के लिए एक संभावित लक्ष्य अणु के रूप में उच्च वोल्टेज-गेट्ड कैल्शियम चैनलों (कैवजेड 3) की $3 उपइकाई की पहचान की, अर्थात इन विट्रो खरोंच प्रवास परख और इन विवो पृष्ठीय त्वचा फ़ोल्ड चैम्बर मॉडल। इन विट्रो परख के लिए, हम प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट्स का इस्तेमाल किया, इन कोशिकाओं Cacnb3 जीन एन्कोडिंग Cav$ 3 प्रोटीन व्यक्त करते हैं, लेकिन depolarization प्रेरित Ca2 + प्रवाह या वोल्टेज पर निर्भर Ca2 + धाराओं की कमी है. हमने इन फाइब्रोब्लास्ट्स में कैव के एक उपन्यास समारोह का वर्णन किया है: कैव$3 इनोसिटोल 1,4,5-ट्राइसफॉस्फेट रिसेप्टर (IP3R) को बांधता है और एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम से कैल्शियम की रिहाई पर प्रतिबंध लगा देता है। चूहों में Cacnb3 जीन के विलोपन IP3 के लिए IP3R की संवेदनशीलता में वृद्धि की ओर जाता है, बढ़ाया सेल प्रवास और त्वचा घाव की मरम्मत में वृद्धि4.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस पांडुलिपि में, हम एक इन विट्रो और विवो घाव भरने परख में वर्णन और प्राप्त परिणामसहसंबंध. इन विट्रो परख के लिए, हम प्राथमिक माउस फाइब्रोब्लास्ट्स4,14,15 जो घाव भरने और ऊ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम डॉ पेट्रा Weissgerber और SPF पशु सुविधा के ट्रांसजीन इकाई (SFB 894 की परियोजना P2) चिकित्सा संकाय और Saarland विश्वविद्यालय, Homburg के चिकित्सा संकाय में नैदानिक और प्रायोगिक सर्जरी के संस्थान में पशु सुविधा धन्यवाद. हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए डॉ एंड्रियास बेक धन्यवाद. इस अध्ययन के लिए ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG) Sonderforschungsbereich (SFB) 894, परियोजना A3 से A.B. और V.F.) द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| 0.9 % NaCl | |||
| 1 ml syringes | BD Plastipak | 303172 | |
| 6 well plate | Corning | 3516 | |
| Biopsy punch | Kai Industries | 48201 | 2 mm |
| Cacnb3 Mouse siRNA Oligo Duplex (Locus ID 12297) | Origene | SR415626 | |
| Depilation cream | any depilation cream | ||
| Dexpanthenol 5% (BEPANTHEN) | Bayer | 3400935940179.00 | (BEPANTHEN) |
| Dihydroxylidinothiazine hydrochloride (Xylazine) | Bayer Health Care | Rompun 2% | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco by life technologies | 41966-029 | |
| Fetal bovine serum | Gibco by life technologies | 10270-106 | |
| Hexagon full nut | |||
| Ketamine hydrochloride | Zoetis | KETASET | |
| Light microscope | Keyence, Osaka, Japan | BZ-8000 | Similar microscopes might be used |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 13778075 | |
| Micro-forceps | |||
| Micro-Scissors | |||
| Mouse restrainer | Home-made | ||
| Normal scissors | |||
| Objective | Nikon | plan apo 10x/0.45 | |
| Opti-MEM | Gibco by life technologies | 51985-026 | |
| Polypropylene sutures | |||
| Screwdriver | |||
| Skin disinfectant (octeniderm) | Schülke & Mayr GmbH | 118212 | |
| Slotted cheese head screw | |||
| Snap ring | |||
| Snap ring plier | |||
| Surgical microscope with camera | Leica | Leica M651 | |
| Titanium frames for the skinfold chamber | IROLA | 160001 | Halteblech M |
| Wire piler |
References
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453, 314-321 (2008).
- Martin, P. Wound healing–aiming for perfect skin regeneration. Science. 276, 75-81 (1997).
- Gabbiani, G., Gabbiani, F., Heimark, R. L., Schwartz, S. M. Organization of actin cytoskeleton during early endothelial regeneration in vitro. Journal of Cell Science. 66, 39-50 (1984).
- Belkacemi, A., et al. IP3 Receptor-Dependent Cytoplasmic Ca(2+) Signals Are Tightly Controlled by Cavbeta3. Cell Reports. 22, 1339-1349 (2018).
- Breuing, K., Eriksson, E., Liu, P., Miller, D. R. Healing of partial thickness porcine skin wounds in a liquid environment. Journal of Surgical Research. 52, 50-58 (1992).
- Colwell, A. S., Krummel, T. M., Kong, W., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. Skin wounds in the MRL/MPJ mouse heal with scar. Wound Repair and Regeneration. 14, 81-90 (2006).
- Vagesjo, E., et al. Accelerated wound healing in mice by on-site production and delivery of CXCL12 by transformed lactic acid bacteria. Proceedings National Academy of Science. 115, 1895-1900 (2018).
- Eming, S. A., et al. Accelerated wound closure in mice deficient for interleukin-10. American Journal of Pathology. 170, 188-202 (2007).
- Sorg, H., Krueger, C., Vollmar, B. Intravital insights in skin wound healing using the mouse dorsal skin fold chamber. Journal of Anatomy. 211, 810-818 (2007).
- Laschke, M. W., Vollmar, B., Menger, M. D. The dorsal skinfold chamber: window into the dynamic interaction of biomaterials with their surrounding host tissue. European Cell and Materials. 22, 147-164 (2011).
- Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. Cell migration. Comprehensive Physiology. 2, 2369-2392 (2012).
- Hofmann, F., Belkacemi, A., Flockerzi, V. Emerging Alternative Functions for the Auxiliary Subunits of the Voltage-Gated Calcium Channels. Current Molecular Pharmacology. 8, 162-168 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Chen, L., et al. Protein 4.1G Regulates Cell Adhesion, Spreading, and Migration of Mouse Embryonic Fibroblasts through the beta1 Integrin Pathway. Journal of Biological Chemistry. 291, 2170-2180 (2016).
- Dewor, M., et al. Macrophage migration inhibitory factor (MIF) promotes fibroblast migration in scratch-wounded monolayers in vitro. FEBS Letters. 581, 4734-4742 (2007).
- Handly, L. N., Wollman, R. Wound-induced Ca(2+) wave propagates through a simple release and diffusion mechanism. Molecular Biology of the Cell. 28, 1457-1466 (2017).
- Cappiello, F., Casciaro, B., Mangoni, M. L. A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration. Journal of Visualized Experiments. (133), 56825 (2018).
- Hernandez Vera, R., Schwan, E., Fatsis-Kavalopoulos, N., Kreuger, J. A Modular and Affordable Time-Lapse Imaging and Incubation System Based on 3D-Printed Parts, a Smartphone, and Off-The-Shelf Electronics. PLoS One. 11, 0167583 (2016).
- Reinhart-King, C. A. Endothelial cell adhesion and migration. Methods in Enzymology. 443, 45-64 (2008).
- Treloar, K. K., Simpson, M. J. Sensitivity of edge detection methods for quantifying cell migration assays. PLoS One. 8, 67389 (2013).
- Pirkmajer, S., Chibalin, A. V. Serum starvation: caveat emptor. American Journal of Physiology-Cell Physioliology. 301, 272-279 (2011).
- Papenfuss, H. D., Gross, J. F., Intaglietta, M., Treese, F. A. A transparent access chamber for the rat dorsal skin fold. Microvascular Research. 18, 311-318 (1979).
- Deoliveira, D., et al. An ear punch model for studying the effect of radiation on wound healing. International Journal of Radiation Biology. 87, 869-877 (2011).
- Chen, L., Mirza, R., Kwon, Y., DiPietro, L. A., Koh, T. J. The murine excisional wound model: Contraction revisited. Wound Repair and Regeneration. 23, 874-877 (2015).
- Dunn, L., et al. Murine model of wound healing. Journal of Visualized Experiment. (75), e50265 (2013).
- Wahedi, H. M., Park, Y. U., Moon, E. Y., Kim, S. Y. Juglone ameliorates skin wound healing by promoting skin cell migration through Rac1/Cdc42/PAK pathway. Wound Repair and Regeneration. 24, 786-794 (2016).
