Implementering av ett ickelinjärt Mikroskop baserat på stimulerad Raman-spridning
Summary
I detta manuskript beskrivs implementeringen av en stimulerad Raman spridning (SRS) Mikroskop, som erhållits genom integration av en SRS experimentell uppsättning med ett Laser scanning Mikroskop. SRS-mikroskopet är baserat på två femtosecondlaser (FS) laserkällor, en TI-Sapphire (TI: sa) och synkroniserad optisk parametrisk oscillator (OPO).
Abstract
Stimulerad Raman spridning (SRS) mikroskopi använder nästan infraröd excitation ljus; Därför, det delar många multi-Photon mikroskopiska Imaging egenskaper. SRS Imaging modalitet kan erhållas med kommersiella laserscanning Mikroskop genom att utrusta med en icke-avskurna framåt detektor med rätt bandpass filter och lock-in förstärkare (Lia) detekterings schema. En Schematisk layout av ett typiskt SRS Mikroskop omfattar följande: två pulsade laserstrålar, (dvs. pumpen och sonden riktad i ett scanning Mikroskop), som måste överlappas i både tid och rum på bildplanet, sedan fokuserat med ett Mikroskop mål i provet genom två scanning speglar (SMs), som raster brännpunkten över ett x-y-plan. Efter interaktion med provet samlas överförda utflödes pulser upp av ett övre mål och mäts med ett framåtdetekterings system insatt i ett inverterat Mikroskop. Pump pulser avlägsnas med en bunt optiska filter, medan sonden pulser som är resultatet av SRS-processen som inträffar i brännvidden av preparatet mäts med en fotodiod (PD). Den avläsning av PD är demodulerade av Lia att extrahera moduleringsdjupet. En tvådimensionell (2D) bild erhålls genom att synkronisera den främre detekterings enheten med Mikroskop skannings enheten. I det här dokumentet beskrivs och demonstreras implementeringen av ett SRS-Mikroskop, liksom rapporteringen av etikettfria bilder av polystyren-pärlor med en diameter på 3 μm. Det är värt att notera att SRS Mikroskop inte är kommersiellt tillgängliga, så för att kunna dra nytta av dessa egenskaper, är den hemgjorda konstruktionen det enda alternativet. Eftersom SRS mikroskopi blir populär på många områden, man tror att denna noggranna Beskrivning av SRS Mikroskop genomförandet kan vara mycket användbart för det vetenskapliga samfundet.
Introduction
I Life Science-tillämpningar har SRS mikroskopi vuxit fram som ett kraftfullt verktyg för etikettfri avbildning. Den grundläggande idén om SRS mikroskopi är att kombinera styrkan i vibrations kontrast och dess förmåga att förvärva bilder på några sekunder.
SRS är en process där frekvens skillnaden mellan två laserstrålar frekvenser (pump signal och Stokes signal vid olika frekvenser) matchar molekylära vibrationer i ett undersökt prov, orsakar stimulerad Raman spridning och en betydande ökning av Stokes-signalen. Till skillnad från linjär Raman-spektroskopi uppvisar SRS ett ickelinjär beroende av de inkommande ljus fälten och producerar sammanhängande strålning. SRS har två grundläggande fördelar: 1) hastighet, vilket gör bilder mindre känsliga för artefakter som härrör från provet rörelse eller nedbrytning, och 2) en utmärkt signal-brus-förhållande (SNR). Dessutom uppvisar SRS ett spektrum som är identisk med den spontana Raman, och SRS signalen är linjärt proportionell mot koncentrationen av den kemiska Bond upphetsad1,2,3,4, 5.
I vårt Mikroskop, en femtosecondlaser (FS) SRS experimentella set-up är integrerat med ett inverterat optiskt mikroskop utrustad med en snabb speglar skanning enhet (figur 1)6,7,8. Två pulsade laserkällor används för att implementera detta Mikroskop. Den första är en FS-TI: sa med en puls varaktighet på cirka 140 FS, repetitionshastighet på 80 MHz, och emissions våglängder i intervallet 680-1080 nm. Den andra, som används som sond balk och pumpas av TI: sa, är en femtosecondlaser synkroniserad optisk parametriska oscillator (SOPO), med en puls varaktighet på cirka 200 FS, repetitionshastighet på 80 MHz, och utsläpp våglängder i intervallet 1000-1600 nm. Det bör noteras att minsta fotons energi skillnad mellan TI: sa och SOPO beam är 2500 cm-1. Därför, med hjälp av denna kombination av lasersystem, endast den höga frekvensen C-H-regionen (2800-3200 cm-1) av Raman spectra kan utforskas6,7,8.
För att inrätta ett SRS-Mikroskop finns det tre viktiga frågor att beakta, vilka beskrivs i de efterföljande styckena. Den första är genomförandet av en hög frekvensmodulering överföringsmetod (se figur 2 och steg 2,1 i protokollet för en beskrivning). I en SRS experimentell undersökning, är en avgörande parameter känsligheten i systemet. En SRS signal detekteras som en liten förändring i intensiteten av excitation balkar; Därför kan det skadas av laser intensitet buller och skott buller. Denna fråga kan lösas genom att integrera detta system med en hög frekvensmodulering överföringsmetod (se figur 2 och steg 2,1 i protokollet för mer information). I denna metod används en elektrooptisk modulator (EOM) för att modulera pumpen. Den modulering som överförs till sond strålen kan sedan detekteras av en PD efter att ha blockerat pump strålen med en bunt optiska filter [stimulerad Raman Gain (SRG) detektions läge]. PD-utgången ansluts med ett lågpassfilter till en lock-in-förstärkare (LIA), som demodulerar den uppmätta signalen. Genom att öka strålens modulerings frekvens till frekvenser över 1 MHz kan den inneboende gränsen för PDs erhållas.
Den andra frågan att ta hänsyn till är installationen av ett mekaniskt fäste som medger att man utför framåtriktad detektering och samtidigt bevarar Mikroskop observation i brightfield. Dessutom måste det minska bullret på grund av mekaniska vibrationer under generering av bilder och för att möjliggöra exakt omplacering av detekterings systemet (se figur 3 och steg 2,2 i protokollet).
Den tredje är synkroniseringen av den signal som förvärvas av fas-känsligt detektions schema, med strålen placerad på provet övervakas av Scan huvudet av mikroskopet. För att förverkliga bilder kräver SMs tre TTL-signaler som görs tillgängliga av Mikroskop styrenheten ansluten till Scan Head enhet: Pixel Clock, Line Sync och Frame Sync. Synkroniseringen uppnås genom att kontrollera med hjälp av ett PCI-kort, de tre TTL-signalerna, och förvärvet av en spänningssignal på utgångskanalen av Lia6,7,8. En hemlagad programvara har utvecklats och beskrivits tidigare6,7,8, medan hårdvaran i synkroniseringssystemet rapporteras i figur 4.
En grundläggande procedur vid utförandet av SRS Imaging är Mikroskop justering. Det realiseras under loppet av fyra steg, som beskrivs i de efterföljande styckena. Den första är den rumsliga överlappningen av två balkar (se steg 3,1 i protokollet). I denna experimentella uppsättning, de två balkar var rumsligt collinearly kombineras med en Dichroic spegel. Det preliminära steget är anpassningen av OPO och TI: sa så att varje når mikroskopet. Sedan, med tanke på OPO som referens balk och dra nytta av en position känslig detektor, TI: sa är rumsligt överlappade till OPO.
Den andra avgörande aspekten är den temporala överlappningen av två balkar (se steg 3,2 i protokollet). Även om pumpen och OPO balkar är perfekt synkroniserade9, eftersom de följer något olika balk stigar inne i OPO bostäder, vid OPO Exit de har en tidsfördröjning på ca 5 ns och rumslig skillnad på 5 cm. Därför, TI: sa och OPO kräver att tidsinställda optiskt för att säkerställa temporala överlappning på provet. Detta är vanligtvis åstadkommas med en fint avstämbara optisk fördröjning linje, som i detta fall infogas mellan TI: sa och Mikroskop (se figur 1). För att erhålla den temporal överlappningen av två strålar, används två tekniker. Den första utförs med hjälp av en snabb PD och oscilloskop, medan den andra är baserad på Auto-och Cross-optiska korrelationer. Med den första tekniken erhålls en grov överlappning av två balkar (osäkerhet på 10 PS), medan en exakt temporala överlappning av två balkar erhålls med hjälp av en cross-correlator (upplösning av 1 FS).
Den tredje avgörande aspekten är anpassningen av de två strålarna inuti mikroskopet (se steg 3,3 i protokollet). Ett preliminärt vitt ljus observation av provet gör det möjligt att individuera önskat synfält (FOV). Efteråt, laserstrålar, in i mikroskopet med en sido port av Mikroskop, är inriktade för att nå PD monterad på den övre delen (figur 3). För en korrekt Bildinsamling krävs dock att ange ett antal parametrar (till exempel pixel dimension och pixel Dwell Time). Provtagningsfrekvensen måste respektera den begränsning som införts av Nyquists sats för att bevara all information i en bild, medan för en korrekt korrespondens mellan de rumsliga koordinaterna för pixlar och SRS-värde mätt i varje pixel, integrationstiden av LIA bör vara lika med eller jämförbar med pixel Dwell-tiden.
I det sista steget av Mikroskop anpassningen, många tester utförs för att optimera den rumsliga och tidsmässiga anpassningen (se steg 3,4 i protokollet). Ett antal transmissions bilder (TI) för både TI: sa och OPO förvärvas för att optimera rumslig överlappning. I en TI används en enda stråle och den överförda strålens intensitet från provet mäts med en PD. När det gäller TI realiseras av OPO, PD utsignalen är direkt ansluten till PCI-kort, medan det i fallet med TI realiseras av TI: sa, är PD utsignalen ansluten till LIA och analog utgång av LIA är ansluten till PCI-kort. Överföringen bilder är mycket användbara för att optimera FOV, belysningen, fokuspositionen för Mikroskop mål och att kontrollera om de två balkar är rumsligt överlappade6,7,8.
Optimeringen av pumpen och sond strålens temporala överlappning erhålls genom att skanna fördröjningen linje med steg om 0,001 mm som motsvarar en 3,3 FS tidsförskjutning och utföra en SRS mätning i en enda punkt i en polystyren pärla prov 3 μm i diameter. Amplituden av en SRS signal mäter värden från Lia, som en funktion av sonden-pump fördröjning, och ger en maximal motsvarande med exakt temporala överlappning av de två balkar6,7,8. Innan du avslutar bör det noteras att alla diskuterade steg är obligatoriska för att få en bild av hög kvalitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
SRS mikroskopi har tagit etikett-fri avbildning till nya höjder, särskilt i studier av komplexa biologiska strukturer såsom lipider, som är grundläggande för celler och cellulära arkitektur. Lipider är involverade i flera fysiologiska vägar såsom produktion av biologiska membran, och de fungerar som biosyntetiska prekursorer och signaltransducers10. Lipider är förpackade i specialiserade intracellulära organeller, även kallad lipid droppar (LDs). Deras diameter varierar från några …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi uppskattar V. Tufano från IMM CNR för hans värdefulla teknisk assistans och Giacomo Cozzi, produktspecialist från Nikon Instruments, för användbara diskussioner och kontinuerligt stöd. Detta arbete stöddes delvis av italienska nationella operativa program PONa3 00025 (BIOforIU) och av euro-bioimaging storskaliga paneuropeiska forskningsinfrastruktur projekt.
Materials
| Acquisation tool | Nikon | Nikon C2Tool | Acquisation supported tool |
| APE Pulse link control software | APE- | APE Pulse link control software | software control |
| Autocorrelator | APE | APE PulseCheck USB 50 | Autocorrelator |
| Detector | Thorlabs | Thorlabs DET10A | Photodiode |
| Detector card | Thorlabs | Thorlabs VRC | IR detector Card |
| Dichroic mirror | Semrock | Semrock FF875-Di01-25X36 | Dichroic mirror |
| Dichroic mirror | Semrock | FF875-Di01-25×36 | Dichroic mirror |
| EOM | Conoptics | (EOM CONOPTICS 3350-160 KD*P). | Pockels cell |
| Fast detector | Thorlabs | Thorlabs DET025AL/M | Photodiode |
| Fast mirror scanning unit | Nikon | C2 | Microscpe scanning head |
| Femtosecond laser Ti:SA | Coherent | Coherent Chameleon Ultra II | Chameleon Ultra II |
| Function generator | TTi | TG5011 AIM – TTi | Function generator |
| Inverted optical microscope | Nikon | Eclipse TE-2000-E, Nikon | Eclipse TE-2000-E, Nikon |
| Lock-in Amplifier | Standford Research System | SR844-200 MHz dual phase | A lock-in amplifier from Stanford Research Systems |
| Notch filter, | Semrock | NF03-808E-25 | Notch filter |
| Optical delay line | Newport | Newport M-ILS200CC | Tunable optical delay line |
| Optical Parametric Oscillator | Coherent | Coherent Compact OPO | Coherent Compact OPO |
| Oscilloscope | WaveRunner | 640Zi 4GHz OSC/LeCroy | Digital Oscilloscope |
| PCI Card | National instrument | NI PCIe 6363 | Data acquisation card |
| Position Sensors Detectors | Newport | Newport Conex PSD9 | Position detector sensor |
| Power meter head | Coherent | PowerMax PM10, | Laser power detector |
| Translation Stages | Thorlabs | Thorlabs PT1/M | Meachnical Translation Stage with Standard Micrometer |
References
- Saar, B. G., et al. Video-Rate Molecular Imaging in Vivo with Stimulated Raman Scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
- Zhang, D., Wang, P., Slipchenko, M. N., Cheng, J. X. Fast Vibrational Imaging of Single Cells and Tissues by Stimulated Raman Scattering Microscopy. Accounts of Chemical Research. 47 (8), 2282-2290 (2014).
- Alfonso-García, A., Mittal, R., Lee, E. S., Potma, E. O. Biological imaging with coherent Raman scattering microscopy: a tutorial. Journal of Biomedical Optics. 19 (7), 071407 (2014).
- Cheng, J. X., Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science. 350 (6264), aaa8870 (2015).
- Camp, C. H., Cicerone, M. T. Chemically sensitive bioimaging with coherent Raman scattering. Nature Photonics. 9 (5), 295-305 (2015).
- D’Arco, A., et al. Subcellular chemical and morphological analysis by stimulated Raman scattering microscopy and image analysis techniques. Biomedical Optics Express. 7 (5), 1853 (2016).
- D’Arco, A., et al. Label-free imaging of small lipid droplets by femtosecond-stimulated Raman scattering microscopy. Journal of Nonlinear Optical Physics & Materials. 26 (4), (2017).
- Ranjan, R., et al. Integration of stimulated Raman gain and stimulated Raman losses detection modes in a single nonlinear microscope. Optics Express. 26 (20), 26317 (2018).
- Reid, D. T., Sun, J., Lamour, T. P., Ferreiro, T. I. Advances in ultrafast optical parametric oscillators. Laser Physics Letters. 8 (1), 8-15 (2011).
- Zumbusch, A., Langbein, W., Borri, P. Nonlinear vibrational microscopy applied to lipid biology. Progress in Lipid Research. 52 (4), 615-632 (2013).
- Suzuki, M., Shinohara, Y., Ohsaki, Y., Fujimoto, T. Lipid droplets: Size matters. Journal of Electron Microscopy. 60 (1), S101-S116 (2011).
- Rizzatti, V., et al. Lipid droplets characterization in adipocyte differentiated 3T3-L1 cells: size and optical density distribution. European Journal of Histochemistry. 57 (3), 159-162 (2013).
- Alfonso Garcia, A., et al. D38-cholesterol as a Raman active probe for imaging intracellular cholesterol storage. Journal of Biomedical Optics. 21 (6), (2016).
- Mukherjee, S., Zha, X., Tabas, I., Maxfield, F. R. Cholesterol distribution in living cells: fluorescence imaging using dehydroergosterol as a fluorescent cholesterol analog. Biophysical Journal. 75 (4), 1915-1925 (1998).
- Fukumoto, S., Fujimoto, T. Deformation of lipid droplets in fixed samples. Histochemistry and Cell Biology. 118 (5), 423-428 (2002).
- Kinkel, A., et al. Oil red-O stains non-adipogenic cells: A precautionary note. Cytotechnology. 46 (1), 49-56 (2004).
- Wei, L., et al. Live-Cell Bioorthogonal Chemical Imaging: Stimulated Raman Scattering Microscopy of Vibrational Probes. Accounts of Chemical Research. 49 (8), 1494-1502 (2016).
- Ozeki, Y., Asai, T., Shou, J., Yoshimi, H. Multicolor Stimulated Raman Scattering Microscopy with Fast Wavelength-Tunable Yb Fiber Laser. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 25 (1), 1-11 (2019).
- Saar, B. G., Contreras-Rojas, L. R., Xie, X. S., Guy, R. H. Imaging Drug Delivery to Skin with Stimulated Raman Scattering Microscopy. Molecular Pharmaceutics. 8 (3), 969-975 (2011).
- Chen, X., et al. Volumetric chemical imaging by stimulated Raman projection microscopy and tomography. Nature Communications. 8, 15117 (2017).
- Ferrara, M. A., Filograna, A., Ranjan, R., Corda, D., Valente, C., Sirleto, L., et al. Threedimensional label-free imaging throughout adipocyte differentiation by stimulated Raman microscopy. PLoS ONE. 14 (5), e0216811 (2019).
