تنفيذ مجهر غير خطي يستند إلى تشتت رامان المحفز
Summary
في هذه المخطوطة، يتم وصف تنفيذ مجهر رامان المحفز (SRS)، الذي تم الحصول عليه من خلال دمج مجموعة تجريبية SRS مع مجهر المسح الضوئي بالليزر. ويستند المجهر SRS على اثنين من مصادر الليزر femtosecond (FS)، وTi-الياقوت (Ti:Sa) ومتزامنة البصرية مذبذب بارامتري (OPO).
Abstract
يستخدم الفحص المجهري المحفز لتشتت رامان (SRS) ضوء الإثارة شبه بالأشعة تحت الحمراء. لذلك، فإنه يشارك العديد من خصائص التصوير المجهري متعدد الفوتون. ويمكن الحصول على طريقة التصوير SRS باستخدام المجاهر التجارية المسح بالليزر عن طريق تجهيز مع كاشف إلى الأمام غير منزوع المسح الضوئي مع مرشحات شريطية مناسبة وقفل في نظام الكشف عن مكبر للصوت (LIA). يتضمن التخطيط التخطيطي لمجهر SRS النموذجي ما يلي: شعاعين ليزريين نابضين (أي المضخة والمسبار الموجهفي مجهر المسح الضوئي)، والتي يجب أن تتداخل في كل من المكان والوقت في مستوى الصورة، ثم تركز على هدف المجهر في العينة من خلال اثنين من مرايا المسح الضوئي (SMs)، والتي النقطية بقعة التركيز عبر مستوى س-y. بعد التفاعل مع العينة، يتم جمع نبضات الإخراج المنقولة من قبل هدف علوي وتقاس بنظام الكشف الأمامي المدرج في المجهر المقلوب. تتم إزالة نبضات المضخة بواسطة كومة من المرشحات البصرية، في حين يتم قياس نبضات المسبار الناتجة عن عملية SRS التي تحدث في الحجم البؤري للعينة بواسطة الصمام الضوئي (PD). يتم تخفيض قراءة PD من قبل LIA لاستخراج عمق التشكيل. يتم الحصول على صورة ثنائية الأبعاد (ثنائية الأبعاد) عن طريق مزامنة وحدة الكشف الأمامي مع وحدة المسح المجهري. في هذه الورقة، يتم وصف تنفيذ مجهر SRS وثبت بنجاح، فضلا عن الإبلاغ عن الصور خالية من التسمية من حبات البوليسترين بأقطار 3 ميكرومتر. ومن الجدير بالذكر أن المجاهر SRS ليست متاحة تجاريا، وذلك من أجل الاستفادة من هذه الخصائص، والبناء محلية الصنع هو الخيار الوحيد. منذ SRS المجهرية أصبحت شعبية في العديد من المجالات، ويعتقد أن هذا الوصف الدقيق لتنفيذ المجهر SRS يمكن أن تكون مفيدة جدا للمجتمع العلمي.
Introduction
في تطبيقات علوم الحياة، ظهرت SRS المجهرية كأداة قوية للتصوير خالية من التسمية. الفكرة الأساسية للميكروسكوب SRS هو الجمع بين قوة التباين الاهتزازي وقدرتهعلى الحصول على الصور في بضع ثوان.
SRS هي عملية يتطابق فيها فرق التردد بين ترددين من أشعة الليزر (إشارة المضخة وإشارة ستوكس في ترددات مختلفة) مع الاهتزاز الجزيئي لعينة تم التحقيق فيها، مما يسبب تشتت رامان المحفز وحدوث تشتت كبير زيادة في إشارة ستوكس. على عكس مطياف رامان الخطي، يعرض SRS اعتمادًا غير خطي على حقول الضوء الواردة وينتج إشعاعًا متماسكًا. SRS له ميزتان أساسيتان: 1) السرعة، مما يجعل الصور أقل حساسية للمصنوعات اليدوية الناشئة عن حركة العينة أو تدهورها، و 2) نسبة ممتازة للإشارة إلى الضوضاء (SNR). وبالإضافة إلى ذلك، SRS يعرض طيف مماثل لرامان عفوية، وإشارة SRSيتناسب خطيا مع تركيز السندات الكيميائية متحمس 1،2،3،4، 5.
في المجهر لدينا، يتم دمج فيمتوثانية (FS) SRS التجريبية الإعداد مع المجهر البصري المقلوب مجهزة وحدة مسح المرايا السريعة (الشكل1)6،7،8. يتم استخدام مصدرين ليزر نابض لتنفيذ هذا المجهر. الأول هو fs-Ti:Sa مع مدة نبض تبلغ حوالي 140 fs، ومعدل التكرار من 80 ميغاهيرتز، وموجات الانبعاثات في نطاق 680-1080 نانومتر. والثانية، التي تستخدم كشعاع مسبار وتضخها شركة Ti:Sa، هي مذبذب بارامتري بصري متزامن فيفيتوثانية (SOPO)، مع مدة نبض تبلغ حوالي 200 fs، ومعدل تكرار قدره 80 ميغاهيرتز، وأطوال موجية للانبعاثات في نطاق 1000-1600 نانومتر. وتجدر الإشارة إلى أن الحد الأدنى من فرق الطاقة الفوتون بين تي: سا وسوبو شعاع هو 2500 سم-1. لذلك، باستخدام هذا المزيج من أنظمة الليزر، فقط منطقة C-H عالية التردد (2800-3200 سم-1)من رامان الأطياف يمكن استكشافها 6،7،8.
من أجل إنشاء مجهر SRS، هناك ثلاث قضايا حاسمة للنظر فيها، والتي يرد وصفها في الفقرات المتعاقبة. الأول هو تنفيذ طريقة نقل التشكيل عالية التردد (انظر الشكل 2 والخطوة 2-1 من البروتوكول للاطلاع على وصف). في تحقيق تجريبي SRS، معلمة حاسمة هي حساسية النظام. يتم الكشف عن إشارة SRS كتغيير صغير في شدة الحزم الإثارة; لذلك، يمكن أن يكون معطوبا من قبل الضوضاء كثافة الليزر والضوضاء النار. ويمكن التغلب على هذه المشكلة عن طريق دمج هذا النظام مع طريقة نقل التشكيل عالية التردد (انظر الشكل 2 والخطوة 2-1 من البروتوكول للاطلاع على التفاصيل). في هذه الطريقة، يتم استخدام المغير الكهربائي البصري (EOM) لتعديل المضخة. ويمكن بعد ذلك الكشف عن التشكيل المنقول إلى شعاع التحقيق بواسطة PD بعد حجب شعاع المضخة مع كومة من المرشحات البصرية [حفز رامان كسب (SRG) وضع الكشف]. يتم توصيل إخراج PD بواسطة مرشح تمرير منخفض إلى مكبر للصوت قفل في (LIA)، الذي demodulates الإشارة المقاسة. وبزيادة تردد التشكيل للشعاع إلى ترددات تزيد على MHz 1، يمكن الحصول على الحد الجوهري للبارافيات الانسيابية.
المسألة الثانية للنظر هو تركيب جبل الميكانيكية التي تسمح لتنفيذ الكشف إلى الأمام وفي الوقت نفسه للحفاظ على مراقبة المجهر في برايتفيلد. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه يتعين عليه اخفاخ الضوضاء الناجمة عن الاهتزاز الميكانيكي أثناء توليد الصور والسماح بإعادة تحديد موضع نظام الكشف بدقة (انظر الشكل 3 والخطوة 2-2 من البروتوكول).
وثالثها هو تزامن الإشارة التي اكتسبها نظام الكشف الحساس للمرحلة، مع وضع الحزمة على العينة التي يرصدها رأس المسح الضوئي للمجهر. من أجل تحقيق الصور، تتطلب SMs ثلاث إشارات TTL التي يتم توفيرها من قبل وحدة تحكم المجهر المتصلة بوحدة رأس المسح الضوئي: ساعة بكسل، ومزامنة الخط، ومزامنة الإطار. يتم تحقيق التزامن عن طريق التحكم باستخدام بطاقة PCI، وإشارات TTL الثلاث، والحصول على إشارة الجهد في قناة الإخراج من LIA6،7،8. وقد تم تطوير برنامج محلي الصنع ووصف سابقا6،7،8، في حين يتم الإبلاغ عن الأجهزة من نظام التزامن في الشكل 4.
إجراء أساسي عند تنفيذ التصوير SRS هو محاذاة المجهر. ويتحقق ذلك على مدى أربع خطوات، يرد وصفها في الفقرات المتعاقبة. الأول هو التداخل المكاني لشعاعين (انظر الخطوة 3-1 من البروتوكول). في هذا الإعداد التجريبي، تم الجمع بين الحزمين مكانياً بواسطة مرآة ثنائية. الخطوة الأولية هي محاذاة OPO وTi:Sa بحيث يصل كل المجهر. ثم، بالنظر إلى OPO كشعاع مرجعي والاستفادة من كاشف موقف حساسة، يتم تداخل Ti:Sa مكانيا إلى OPO.
والجانب الحاسم الثاني هو التداخل الزمني لشعاعين (انظر الخطوة 3-2 من البروتوكول). حتى لو كانت المضخةوالحزم OPO متزامنة تماما 9، لأنها تتبع مسارات شعاع مختلفة قليلا داخل السكن OPO، في خروج OPO لديهم تأخير الوقت من حوالي 5 NS والفرق المكاني من 5 سم. لذلك، يتطلب Ti:Sa وOPO إعادة توقيت بصري لضمان التداخل الزمني في العينة. ويتم ذلك عادة مع خط تأخير بصري قابل للضبط بدقة، والذي يتم إدراجه في هذه الحالة بين تي: سا والمجهر (انظر الشكل1). من أجل الحصول على التداخل الزمني لشعاعين، يتم استخدام اثنين من التقنيات. يتم تنفيذ الأول باستخدام PD سريع ومنظار الذبذبات، في حين أن الثاني يستند إلى الارتباطات التلقائية والبصرية. باستخدام التقنية الأولى، يتم الحصول على تداخل تقريبي من شعاعين (عدم اليقين من 10 PS)، في حين يتم الحصول على تداخل زمني دقيق من اثنين من الحزم باستخدام عبر correlator (القرار من 1 fs).
الجانب الحاسم الثالث هو محاذاة الحزم اثنين داخل المجهر (انظر الخطوة 3.3 من البروتوكول). تسمح المراقبة الأولية للضوء الأبيض للعينة بتقسيم مجال الرؤية المطلوب (FOV). بعد ذلك، يتم محاذاة أشعة الليزر، ودخول المجهر عن طريق منفذ جانبيمن المجهر، من أجل الوصول إلى PD شنت على الجزء العلوي (الشكل 3). ومع ذلك، للحصول على صورة صحيحة، يلزم تعيين عدد من المعلمات (على سبيل المثال، بُعد البكسل ووقت البكسل). يجب أن يحترم تردد أخذ العينات القيد الذي تفرضه مفرق Nyquist من أجل الحفاظ على جميع المعلومات في صورة، في حين أن المراسلات الصحيحة بين الإحداثيات المكانية للبيكسلات وقيمة SRS تقاس في كل بكسل، ووقت التكامل من LIA يجب أن تكون مساوية أو مماثلة لوقت يسكن بكسل.
في الخطوة الأخيرة من محاذاة المجهر، يتم إجراء العديد من الاختبارات لتحسين المحاذاة المكانية والزمنية (انظر الخطوة 3.4 من البروتوكول). يتم الحصول على عدد من صور الإرسال (TI) لكل من Ti:Sa وOPO من أجل تحسين التداخل المكاني. في TI، يتم استخدام شعاع واحد، ويتم قياس كثافة شعاع المرسلة من العينة بواسطة PD. في حالة TI التي حققتها OPO، يتم توصيل إشارة إخراج PD مباشرة إلى بطاقة PCI، في حين أنه في حالة TI التي حققتها Ti: Sa، يتم توصيل إشارة إخراج PD إلى LIA ويتم توصيل الإخراج التناظرية من LIA إلى بطاقة PCI. صور الإرسال مفيدة جدا لتحسين FOV، والإضاءة، والموقف البؤري لأهداف المجهر والتحقق مما إذاكانت تتداخل الحزم اثنين من الناحية المكانية 6،7،8.
يتم الحصول على التحسين من المضخة والتداخل الزمني لشعاع المسبار عن طريق مسح خط التأخير مع خطوات 0.001 مم المقابلة ل3.3 fs التحول الزمني وتنفيذ قياس SRS في نقطة واحدة من عينة حبة البوليسترين 3 ميكرومتر في القطر. السعة من إشارة SRS يقيس القيم من ليا، كدالة لتأخير مضخة التحقيق، ويوفر الحد الأقصىالمقابلة مع التداخل الزمني الدقيق من الحزم اثنين 6،7،8. قبل أن تختتم، تجدر الإشارة إلى أن جميع الخطوات التي نوقشت إلزامية للحصول على صورة عالية الجودة.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد اتخذت SRS المجهريالتصوير خالية من التسمية إلى آفاق جديدة، وخاصة في دراسات الهياكل البيولوجية المعقدة مثل الدهون، والتي هي أساسية للخلايا والهندسة المعمارية الخلوية. وتشارك الدهون في مسارات فسيولوجية متعددة مثل إنتاج الأغشية البيولوجية، وأنها بمثابة السلائف التركيبية الحيوية ومحولا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن نقدر V. توفانو من IMM CNR لمساعدته التقنية القيمة وجياكومو كوزي، أخصائي المنتج من أدوات نيكون، لمناقشات مفيدة والدعم المستمر. وقد تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل البرامج التنفيذية الوطنية الإيطالية PONa3 00025 (BIOforIU) وEuro-Bioimaging على نطاق واسع panEuropean مشروع البنية التحتية للبحوث.
Materials
| Acquisation tool | Nikon | Nikon C2Tool | Acquisation supported tool |
| APE Pulse link control software | APE- | APE Pulse link control software | software control |
| Autocorrelator | APE | APE PulseCheck USB 50 | Autocorrelator |
| Detector | Thorlabs | Thorlabs DET10A | Photodiode |
| Detector card | Thorlabs | Thorlabs VRC | IR detector Card |
| Dichroic mirror | Semrock | Semrock FF875-Di01-25X36 | Dichroic mirror |
| Dichroic mirror | Semrock | FF875-Di01-25×36 | Dichroic mirror |
| EOM | Conoptics | (EOM CONOPTICS 3350-160 KD*P). | Pockels cell |
| Fast detector | Thorlabs | Thorlabs DET025AL/M | Photodiode |
| Fast mirror scanning unit | Nikon | C2 | Microscpe scanning head |
| Femtosecond laser Ti:SA | Coherent | Coherent Chameleon Ultra II | Chameleon Ultra II |
| Function generator | TTi | TG5011 AIM – TTi | Function generator |
| Inverted optical microscope | Nikon | Eclipse TE-2000-E, Nikon | Eclipse TE-2000-E, Nikon |
| Lock-in Amplifier | Standford Research System | SR844-200 MHz dual phase | A lock-in amplifier from Stanford Research Systems |
| Notch filter, | Semrock | NF03-808E-25 | Notch filter |
| Optical delay line | Newport | Newport M-ILS200CC | Tunable optical delay line |
| Optical Parametric Oscillator | Coherent | Coherent Compact OPO | Coherent Compact OPO |
| Oscilloscope | WaveRunner | 640Zi 4GHz OSC/LeCroy | Digital Oscilloscope |
| PCI Card | National instrument | NI PCIe 6363 | Data acquisation card |
| Position Sensors Detectors | Newport | Newport Conex PSD9 | Position detector sensor |
| Power meter head | Coherent | PowerMax PM10, | Laser power detector |
| Translation Stages | Thorlabs | Thorlabs PT1/M | Meachnical Translation Stage with Standard Micrometer |
References
- Saar, B. G., et al. Video-Rate Molecular Imaging in Vivo with Stimulated Raman Scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
- Zhang, D., Wang, P., Slipchenko, M. N., Cheng, J. X. Fast Vibrational Imaging of Single Cells and Tissues by Stimulated Raman Scattering Microscopy. Accounts of Chemical Research. 47 (8), 2282-2290 (2014).
- Alfonso-García, A., Mittal, R., Lee, E. S., Potma, E. O. Biological imaging with coherent Raman scattering microscopy: a tutorial. Journal of Biomedical Optics. 19 (7), 071407 (2014).
- Cheng, J. X., Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science. 350 (6264), aaa8870 (2015).
- Camp, C. H., Cicerone, M. T. Chemically sensitive bioimaging with coherent Raman scattering. Nature Photonics. 9 (5), 295-305 (2015).
- D’Arco, A., et al. Subcellular chemical and morphological analysis by stimulated Raman scattering microscopy and image analysis techniques. Biomedical Optics Express. 7 (5), 1853 (2016).
- D’Arco, A., et al. Label-free imaging of small lipid droplets by femtosecond-stimulated Raman scattering microscopy. Journal of Nonlinear Optical Physics & Materials. 26 (4), (2017).
- Ranjan, R., et al. Integration of stimulated Raman gain and stimulated Raman losses detection modes in a single nonlinear microscope. Optics Express. 26 (20), 26317 (2018).
- Reid, D. T., Sun, J., Lamour, T. P., Ferreiro, T. I. Advances in ultrafast optical parametric oscillators. Laser Physics Letters. 8 (1), 8-15 (2011).
- Zumbusch, A., Langbein, W., Borri, P. Nonlinear vibrational microscopy applied to lipid biology. Progress in Lipid Research. 52 (4), 615-632 (2013).
- Suzuki, M., Shinohara, Y., Ohsaki, Y., Fujimoto, T. Lipid droplets: Size matters. Journal of Electron Microscopy. 60 (1), S101-S116 (2011).
- Rizzatti, V., et al. Lipid droplets characterization in adipocyte differentiated 3T3-L1 cells: size and optical density distribution. European Journal of Histochemistry. 57 (3), 159-162 (2013).
- Alfonso Garcia, A., et al. D38-cholesterol as a Raman active probe for imaging intracellular cholesterol storage. Journal of Biomedical Optics. 21 (6), (2016).
- Mukherjee, S., Zha, X., Tabas, I., Maxfield, F. R. Cholesterol distribution in living cells: fluorescence imaging using dehydroergosterol as a fluorescent cholesterol analog. Biophysical Journal. 75 (4), 1915-1925 (1998).
- Fukumoto, S., Fujimoto, T. Deformation of lipid droplets in fixed samples. Histochemistry and Cell Biology. 118 (5), 423-428 (2002).
- Kinkel, A., et al. Oil red-O stains non-adipogenic cells: A precautionary note. Cytotechnology. 46 (1), 49-56 (2004).
- Wei, L., et al. Live-Cell Bioorthogonal Chemical Imaging: Stimulated Raman Scattering Microscopy of Vibrational Probes. Accounts of Chemical Research. 49 (8), 1494-1502 (2016).
- Ozeki, Y., Asai, T., Shou, J., Yoshimi, H. Multicolor Stimulated Raman Scattering Microscopy with Fast Wavelength-Tunable Yb Fiber Laser. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 25 (1), 1-11 (2019).
- Saar, B. G., Contreras-Rojas, L. R., Xie, X. S., Guy, R. H. Imaging Drug Delivery to Skin with Stimulated Raman Scattering Microscopy. Molecular Pharmaceutics. 8 (3), 969-975 (2011).
- Chen, X., et al. Volumetric chemical imaging by stimulated Raman projection microscopy and tomography. Nature Communications. 8, 15117 (2017).
- Ferrara, M. A., Filograna, A., Ranjan, R., Corda, D., Valente, C., Sirleto, L., et al. Threedimensional label-free imaging throughout adipocyte differentiation by stimulated Raman microscopy. PLoS ONE. 14 (5), e0216811 (2019).
