Мышь Модель васкуляризированной гетеротопной трансплантации селезенки для изучения биологии селезенки и трансплантации иммунитета
Summary
Этот протокол детализирует хирургические шаги мышиной модели васкуляризированной трансплантации гетеротопической селезенки, технически сложной модели, которая может служить мощным инструментом в изучении судьбы и долговечности клеток селезенки, механизмов различных селезенки популяций клеток в прогрессировании заболевания и трансплантации иммунитета.
Abstract
Селезенка является уникальным лимфоидным органом, который играет важную роль в гомеостазе иммунной и гематопойетической систем. Пациенты, которые подверглись спленэктомии, независимо от осаждения причин склонны к развитию подавляющего пост-спленэктомии инфекции и опыт повышенный риск глубокого венозного тромбоза и злокачественных новообразований. Недавно эпидемиологические исследования показали, что спленэктомия может быть связана с возникновением сердечно-сосудистых заболеваний, что свидетельствует о том, что физиологические функции селезенки еще не полностью признаны. Здесь мы представляем модель вылагостающих гетеротопических трансплантаций селезенки, которая не только может быть использована для изучения функции и поведенческой активности подмножеств селезенки иммунной клетки в различных биологических процессах, но и может быть мощным инструментом для тестирования терапевтический потенциал трансплантации селезенки при определенных заболеваниях. Основные хирургические шаги этой модели включают сбор донорской селезенки, удаление реципиента родной селезенки, и реваскуляризации селезенки трансплантата. Используя конгенические штаммы мыши (например, мыши с CD45.1/CD45.2 фонами), мы заметили, что после сингенной трансплантации, как донорские селезенки лимфоцитов и миелоидные клетки мигрировали из трансплантата уже после операционный день 1, в соответствии с приток нескольких типов клеток-реципиентов, тем самым генерируя уникальную химеру. Несмотря на относительно сложные методы, эта процедура может быть выполнена с коэффициентом успеха 90%. Эта модель позволяет отслеживать судьбу, долговечность и функцию спленоцитов во время устойчивого состояния и в условиях болезни после трансплантации селезенки, тем самым предлагая прекрасную возможность открыть для себя определенную роль для селезенки полученных иммунных клеток в различных процессов заболевания.
Introduction
Селезенка является крупнейшим вторичным лимфоидным органом в организме и имеет решающее значение в иммунной и гематопойетической систем. Его функции в основном выполняются двумя морфологически отдельными отсеками, красной мякотью и белой мякотью1. Красная мякоть представляет собой трехмерную сетку из венозных пазух и селезенки, которые состоят из ретикулярных волокон, ретикулярных клеток и связанных с ними макрофагов. Эта уникальная структура позволяет красной мякоти выступать в качестве эффективного фильтра крови, который удаляет посторонние материалы и старые или поврежденные эритроциты. Белая мякоть включает в себя фолликулы, маргинальные зоны, и периартериолярных лимфоидных оболочек (PALS) и является важным местом для антигена захвата и обработки, лимфоцитов самонаведения, преобразования, распространения и созревания2. Тем не менее, селезенка обычно рассматривается как незаменимый орган, потому что другие лимфатические органы, такие как лимфатические узлы, также могут выполнять некоторые из своих функций и потеря селезенки обычно не приводит к смерти. Поэтому спленэктомия широко выполняется в качестве терапевтического метода для пациентовс селезенкой или доброкачественными гематологическими заболеваниями 3. Однако пациенты с спленэктомией сталкиваются с рядом длительных осложнений. Бактериальные инфекции являются наиболее признанными осложнениями спленэктомии4,5. В последнее время подавляющее пост-спленэктомии сепсис был признан интенсивным осложнением спленэктомии, связанные с высокой смертностью6. Кроме того, последние эпидемиологические исследования показывают, что спленэктомия может быть связана с возникновением сердечно-сосудистых заболеваний, предполагая, что дальнейшие физиологические функции селезенки еще предстоит изучить7,8.
В клинике были использованы аутотрансплантация селезенки и аллотрансплантация селезенки. В настоящее время аутотрансплантация селезенки путем имплантации секций селезенки в мешки, созданные в большей области, рассматривается как единственная возможность для сохранения селезенки после травматической спленэктомии9,10. Тем не менее, эффективность этой операции является спорным, как послеоперационные осложнения, как асептический некроз селезенки и мелкой непроходимости кишечника из-за послеоперационных спаек может произойти11. Аллотрансплантация селезенки участвует в многовисцеральной трансплантации12. Клинические данные от многовисцеральной трансплантации предполагает, что аллотрансплантация селезенки может играть защитную роль в отторжении аллотрансплантата тонкой кишки, не вызывая трансплантата против хозяина болезни (GVHD)12. Однако литература о благотворном воздействии аллотрансплантации селезенки как компонента многовисцеральной трансплантации по-прежнему ограничена, и основные механизмы еще предстоит определить. В 2006 году Яир Райснер и др. сообщили, что пересадка ткани эмбриональной селезенки свиньи, которая не имеет Т-клеток для мышей, может вылечить гемофилию А, генетическое заболевание, не вызывая GVHD13, поддерживая, что трансплантация селезенки имеет терапевтические перспективы в определенных заболеваний. Поэтому необходимо провести дальнейшие исследования терапевтического потенциала трансплантации селезенки.
Модели трансплантации селезенки животных являются ценными для изучения недооцененной функции иммунных клеток селезенки при прогрессировании заболевания, а также для проверки потенциального терапевтического эффекта трансплантации селезенки. Экспериментальные модели пересадки цельной селезенки были задокументированы с начала 1900-х годов, как было рассмотрено Коэном14. В 1969 году Коберн Ричард J. и Ли и др. подробно техники трансплантации селезенки у крыс15,16. Совсем недавно, Swirski FK et al. описал модель мыши трансплантации селезенки17. По сравнению с крысиными моделями, мышиные модели трансплантации селезенки более привлекательны из-за ряда присущих ей преимуществ. Например, используя модель мыши, мы можем получить доступ к обширному разнообразию реагентов, недоступных для моделей крыс. Кроме того, с помощью конгенических мышей (например, мышей с CD45.1/CD45.2 фоне), сингенной трансплантации селезенки позволяет отслеживать судьбу, долговечность, и функции спленоцитов18. На основе работы Swirski FK et al.17, мы дополнительно установили этот упрощенный и расширенный протокол трансплантации селезенки у мышей. Описанный ниже протокол сочетает в себе как надежность, так и осуществимость в стандартизированном порядке и может быть использован в качестве инструмента для изучения биологии селезенки и иммунитета к трансплантации.
Protocol
Representative Results
Discussion
Убедительные данные свидетельствуют о том, что моноциты селезенки играют важную роль в стерильных воспалительных процессах, таких как атеросклероз19, острый ишемический мозг20 или травмы легких18, а также травмы имиокарда I /R и реконструкция<sup class="xr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодаря Северо-Западного университета Всеобъемлющий центр трансплантации и Фейнберг школы медицины исследований программы для ресурсов и финансирования поддержки. В частности, поток Цитометрии и гистологии услуги были предоставлены Северо-Западного университета потока цитометрии основных средств и мышь гистологии и фенотипирования лаборатории, соответственно, оба из которых поддерживаются NCI P30-CA060553 награжден Роберт H Лурье Всеобъемлющий онкологический центр. Мы благодарим мистера Нейта Эспарсу за коррективы этой рукописи.
Materials
| Ketamine | Wyeth | 206205-01 | |
| Xylazine | Lloyd Laboratories | 139-236 | |
| Heparin solution | Abraxis Pharmaceutical Products | 504031 | |
| Injection grade normal saline | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-20 | |
| 70% Ethanol | Pharmco Products Inc. | 111000140 | |
| ThermoCare Small Animal ICU System | Thermocare, Inc. | ||
| Adson Forceps | Roboz Surgical Instruments | RS-5230 | |
| Derf Needle Holder | Roboz Surgical Instruments | RS-7822 | |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors | Roboz Surgical Instruments | RS-5881 | |
| Micro-clip | Roboz Surgical Instruments | RS-5420 | |
| 7-0 silk | Braintree Scientific | SUT-S 103 | |
| 11-0 nylon on 4-mm (3/8) needle | Sharpoint DR4 | AK-2119 | |
| Ms CD45.2 antibody | BD Bioscience | 553772 | |
| Ms CD45.1 antibody | BD Bioscience | 553776 | |
| Ms CD11b antibody | BD Bioscience | 557657 | |
| Ms B220 antibody | BD Bioscience | 553089 | |
| Ms Ly6C antibody | eBioscience | 48-5932-80 | |
| Ms Ly6G antibody | BD Bioscience | 561236 | |
| Ms F4/80 antibody | BD Bioscience | 565614 | |
| Ms CD11c antibody | BD Bioscience | 558079 | |
| Ms CD3 antibody | eBioscience | 48-0032-82 | |
| Ms CD4 antibody | BD Bioscience | 552051 | |
| Ms CD8 antibody | BD Bioscience | 563786 | |
| LIVE/DEAD™ Fixable Violet Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher | L34955 |
References
- Cesta, M. F. Normal structure, function, and histology of the spleen. Toxicologic Pathology. 34 (5), 455-465 (2006).
- Mebius, R. E., Kraal, G. Structure and function of the spleen. Nature Reviews Immunology. 5 (8), 606-616 (2005).
- Misiakos, E. P., Bagias, G., Liakakos, T., Machairas, A. Laparoscopic splenectomy: Current concepts. World Journal of Gastrointestinal Endoscopy. 9 (9), 428-437 (2017).
- Kristinsson, S. Y., Gridley, G., Hoover, R. N., Check, D., Landgren, O. Long-term risks after splenectomy among 8,149 cancer-free American veterans: a cohort study with up to 27 years follow-up. Haematologica. 99 (2), 392-398 (2014).
- Thai, L. H., et al. Long-term complications of splenectomy in adult immune thrombocytopenia. Medicine (Baltimore). 95 (48), e5098 (2016).
- Sinwar, P. D. Overwhelming post splenectomy infection syndrome – review study. International Journal of Surgery. 12 (12), 1314-1316 (2014).
- Rorholt, M., Ghanima, W., Farkas, D. K., Norgaard, M. Risk of cardiovascular events and pulmonary hypertension following splenectomy – a Danish population-based cohort study from 1996-2012. Haematologica. 102 (8), 1333-1341 (2017).
- Crary, S. E., Buchanan, G. R. Vascular complications after splenectomy for hematologic disorders. Blood. 114 (14), 2861-2868 (2009).
- Di Carlo, I., Pulvirenti, E., Toro, A. A new technique for spleen autotransplantation. Surgical Innovation. 19 (2), 156-161 (2012).
- Holdsworth, R. J. Regeneration of the spleen and splenic autotransplantation. British Journal of Surgery. 78 (3), 270-278 (1991).
- Tzoracoleftherakis, E., Alivizatos, V., Kalfarentzos, F., Androulakis, J. Complications of splenic tissue reimplantation. Annals of the Royal College of Surgeons of England. 73 (2), 83-86 (1991).
- Kato, T., et al. Transplantation of the spleen: effect of splenic allograft in human multivisceral transplantation. Annals of Surgery. 246 (3), 436-444 (2007).
- Aronovich, A., et al. Correction of hemophilia as a proof of concept for treatment of monogenic diseases by fetal spleen transplantation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (50), 19075-19080 (2006).
- Cohen, E. A. Splenosis; review and report of subcutaneous splenic implant. Archives of surgery. 69 (6), 777-784 (1954).
- Coburn, R. J. Spleen transplantation in the rat. Transplantation. 8 (1), 86-88 (1969).
- Lee, S., Orloff, M. J. A technique for splenic transplantation in the rat. Surgery. 65 (3), 436-439 (1969).
- Swirski, F. K., et al. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325 (5940), 612-616 (2009).
- Hsiao, H. M., et al. Spleen-derived classical monocytes mediate lung ischemia-reperfusion injury through IL-1beta. Journal of Clinical Investigation. 128 (7), 2833-2847 (2018).
- Robbins, C. S., et al. Extramedullary hematopoiesis generates Ly-6C(high) monocytes that infiltrate atherosclerotic lesions. Circulation. 125 (2), 364-374 (2012).
- Kim, E., Yang, J., Beltran, C. D., Cho, S. Role of spleen-derived monocytes/macrophages in acute ischemic brain injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 34 (8), 1411-1419 (2014).
- Bronte, V., Pittet, M. J. The spleen in local and systemic regulation of immunity. Immunity. 39 (5), 806-818 (2013).
- Wang, N. P., et al. Recruitment of macrophages from the spleen contributes to myocardial fibrosis and hypertension induced by angiotensin II. Journal of the Renin-Angiotensin-Aldosterone System. 18 (2), 1470320317706653 (2017).
- Tian, Y., et al. The spleen contributes importantly to myocardial infarct exacerbation during post-ischemic reperfusion in mice via signaling between cardiac HMGB1 and splenic RAGE. Basic Research in Cardiology. 111 (6), 62 (2016).
- Jang, Y., et al. Cutting Edge: Check Your Mice-A Point Mutation in the Ncr1 Locus Identified in CD45.1 Congenic Mice with Consequences in Mouse Susceptibility to Infection. Journal of Immunology. 200 (6), 1982-1987 (2018).
