Formation de carbonate de calcium en présence d'additifs biopolymères

Summary

Nous décrivons un protocole pour la précipitation et la caractérisation des cristaux de carbonate de calcium qui se forment en présence de biopolymères.

Abstract

La biominéralisation est la formation de minéraux en présence de molécules organiques, souvent liées à des rôles fonctionnels et/ou structurels dans les organismes vivants. Il s’agit d’un processus complexe et, par conséquent, un système simple, in vitro, est nécessaire pour comprendre l’effet des molécules isolées sur le processus de biominéralisation. Dans de nombreux cas, la biominéralisation est dirigée par des biopolymères dans la matrice extracellulaire. Afin d’évaluer l’effet des biopolymères isolés sur la morphologie et la structure de la calcite in vitro, nous avons utilisé la méthode de diffusion de vapeur pour la précipitation du carbonate de calcium, la microscopie électronique à balayage et le micro Raman pour la caractérisation, et l’absorption ultraviolet-visible (UV/Vis) pour mesurer la quantité d’un biopolymère dans les cristaux. Dans cette méthode, nous exposons les biopolymères isolés, dissous dans une solution de chlorure de calcium, à l’ammoniac gazeux et au dioxyde de carbone qui proviennent de la décomposition du carbonate d’ammonium solide. Dans les conditions où le produit de solubilité du carbonate de calcium est atteint, le carbonate de calcium se précipite et des cristaux sont formés. Le carbonate de calcium a différents polymorphes qui diffèrent dans leur stabilité thermodynamique : carbonate de calcium amorphe, vaterite, aragonite et calcite. En l’absence de biopolymères, dans des conditions propres, le carbonate de calcium est principalement présent sous forme de calcite, qui est le polymorphe thermodynamiquement stable de carbonate de calcium. Cette méthode examine l’effet des additifs biopolymères sur la morphologie et la structure des cristaux de carbonate de calcium. Ici, nous démontrons le protocole par l’étude d’une protéine bactérienne extracellulaire, TapA, sur la formation de cristaux de carbonate de calcium. Plus précisément, nous nous concentrons sur la mise en place expérimentale, et les méthodes de caractérisation, telles que la microscopie optique et électronique ainsi que la spectroscopie Raman.

Introduction

La biominéralisation est la formation de minéraux en présence de molécules organiques, souvent liées à des rôles fonctionnels et/ou structurels dans les organismes vivants. La biominéralisation peut être intracellulaire, comme dans la formation de magnétite à l’intérieur des bactéries magnétotaxiques¹, ou extracellulaires, comme dans la formation de carbonate de calcium dans les pointes d’oursins², d’hydroxyapatite qui est liée au collagène dans os³ et de l’émail qui est associé à l’amélogénine dans les dents⁴. La biominéralisation est un processus complexe qui dépend de nombreux paramètres dans l’organisme vivant. Par conséquent, afin de simplifier le système à l’étude, il est nécessaire d’évaluer l’effet des composants distincts sur le processus. Dans de nombreux cas, la biominéralisation est induite par la présence de biopolymères extracellulaires. Le but de la méthode présentée ici est le suivant: (1) Pour former des cristaux de carbonate de calcium en présence de biopolymères isolés in vitro, en utilisant une méthode de diffusion de vapeur. (2) Étudier l’effet des biopolymères sur la morphologie et la structure du carbonate de calcium.

Trois méthodes principales pour précipiter le carbonate de calcium in vitro en présence d’additifs organiques sont utilisées^5,6. La première méthode, que nous appellerons la méthode de solution, est basée sur le mélange d’un sel soluble de calcium (par exemple, CaCl₂) avec un sel soluble de carbonate (par exemple, carbonate de sodium). Le processus de mélange peut être effectué de plusieurs façons: à l’intérieur d’un réacteur avec trois cellules qui sont séparées par des membranes poreuses⁷. Ici, chacune des cellules extérieures contient un sel soluble et la cellule centrale contient une solution avec l’additif à tester. Calcium et carbonate diffusent de l’extérieur à la cellule moyenne, ce qui entraîne la précipitation du carbonate de calcium moins soluble lorsque les concentrations de calcium et de carbonate dépassent leur produit de solubilité, K_sp -[Ca^2′][CO 3) ^2-]. Une méthode de mélange supplémentaire est la procédure de double-jet⁸. Dans cette méthode, chaque sel soluble est injecté à partir d’une seringue séparée à une solution agitée contenant l’additif, où le carbonate de calcium se précipite. Ici, l’injection et donc le taux de mixage est bien contrôlé, contrairement à la méthode précédente où le mélange est contrôlé par diffusion.

La deuxième méthode utilisée pour cristalliser CaCO₃ est la méthode Kitano⁹. Cette méthode est basée sur l’équilibre carbonate/hydrogène carbonate (2HCO₃^– _(aq) ‘ Ca 2_{‘ (aq)} CaCO 3_(s) ‘ CO 2_(g) ‘ H₂O _(l)). Ici, le CO₂ est regroupé dans une solution contenant CaCO₃ sous une forme solide, déplaçant l’équilibre vers la gauche et dissolvant ainsi le carbonate de calcium. Le carbonate de calcium non dissous est filtré et les additifs désirés sont ajoutés à la solution riche en bicarbonate. Le CO₂ est ensuite autorisé à s’évaporer, déplaçant ainsi la réaction vers la droite, formant du carbonate de calcium en présence des additifs.

La troisième méthode de cristallisation du carbonate de calcium, que nous décrirarons ici, est la méthode de diffusion de vapeur¹⁰. Dans cette configuration, l’additif organique, dissous dans une solution de chlorure de calcium, est placé dans une chambre fermée près du carbonate d’ammonium sous forme de poudre. Lorsque la poudre de carbonate d’ammonium se décompose en dioxyde de carbone et en ammoniac, elle se diffuse dans la solution contenant des ions de calcium (p. ex. CaCl₂), et le carbonate de calcium est précipité (voir la figure 1 pour illustrer). Les cristaux de carbonate de calcium peuvent se développer par des précipitations lentes ou par des précipitations rapides. Pour les précipitations lentes, une solution contenant l’additif dans la solution CaCl₂ est placée dans un dessiccateur à côté de la poudre de carbonate d’ammonium. Dans les précipitations rapides, décrites en longueur dans le protocole, la solution additive et le carbonate d’ammonium sont rapprochés dans une plaque multi-puits. La méthode des précipitations lentes produira moins de centres de nucléation et de cristaux plus gros, et les précipitations rapides se traduiront par plus de centres de nucléation et de cristaux plus petits.

Les méthodes décrites ci-dessus diffèrent dans leur complexité technique, dans le niveau de contrôle et dans le taux du processus de précipitation. La méthode de mélange nécessite une configuration spéciale⁶ pour le double jet et le système à trois cellules. Dans la méthode de mélange, la présence d’autres contre-ions solubles (p. ex., Na^,Cl^{–) 6} est inévitable, alors que dans la méthode Kitano, le calcium et le carbonate (bi) sont les seuls ions en solution et il n’implique pas la présence de contre ions (p. ex., Na^,Cl^–). En outre, la méthode de mélange nécessite des volumes relativement importants et, par conséquent, il n’est pas approprié pour travailler avec des biopolymères coûteux. L’avantage du double jet est qu’il est possible de contrôler le taux d’injection de solution et qu’il s’agit d’un processus rapide par rapport à d’autres méthodes.

L’avantage de la méthode Kitano et de la méthode de diffusion de vapeur est que la formation de carbonate de calcium est contrôlée par la diffusion du CO₂ dans/hors d’une solution CaCl_2, permettant ainsi de sonder des processus de nucléation et de précipitation plus lents ¹¹ Ans, états-unis ( ^{, 12}. En outre, la formation de carbonate de calcium par diffusion du CO₂ peut ressembler à des processus de calcification in vivo^13,14,15. Dans cette méthode, des cristaux bien définis et séparés sont formés¹⁶. Enfin, l’effet d’un ou plusieurs biopolymères sur la formation de carbonate de calcium peut être testé. Cela permet une étude systématique de l’effet d’une série de concentrations additives sur la formation de carbonate de calcium ainsi qu’une étude des mélanges de biopolymères – tous effectués de manière contrôlée. Cette méthode est adaptée à une utilisation avec une large gamme de concentrations et de volumes d’additifs. Le volume minimal utilisé est d’environ 50 l et donc cette méthode est avantageuse lorsqu’il y a une quantité limitée de biopolymères disponibles. Le volume maximal dépend de l’accessibilité d’une plus grande plaque de puits, ou du dessiccateur dans lequel la plaque ou le bécher contenant CaCl₂ doivent être insérés. La méthode décrite ci-dessous a été optimisée pour travailler dans une plaque de 96 puits avec un biopolymère choisi pour être la protéine TapA¹⁷.

Protocol

1. Cristallisation de carbonate de calcium Préparation et optimisation du contrôle Préparer des morceaux de verre propres. Utilisez la même procédure de nettoyage pour nettoyer la verrerie. Utilisez un stylo diamant pour couper des morceaux d’une lame de microscope en verre afin qu’ils s’adaptent dans un puits d’une plaque de 96 puits.REMARQUE : Les pièces de 5 mm x 5 mm doivent s’adapter en grande partie. Placez les morceaux de verre dans un bécher avec …

Representative Results

Un schéma de la mise en place expérimentale est montré dans la figure 1. En bref, la méthode de diffusion est utilisée afin de former des cristaux de carbonate de calcium dans des plaques de 96 puits et de tester l’effet des biopolymères sur la morphologie et la structure des cristaux de carbonate de calcium. Dans ces expériences, le carbonate d’ammonium est décomposé en ammoniac et co2, qui se diffusent en solutions de carbonate de calcium, ce qui entraîne la formation …

Discussion

La méthode décrite ici vise à former des cristaux de carbonate de calcium en présence d’additifs organiques et à évaluer l’effet des biopolymères organiques sur la morphologie et la structure des cristaux de carbonate de calcium in vitro. La méthode est basée sur la comparaison des cristaux formés en présence des additifs organiques aux cristaux de calcite formés dans l’expérience de contrôle. Nous avons montré comment utiliser la méthode de diffusion pour former les cristaux de carbonate de calcium, comm…

Materials

Acetic acid	Gadot	64-19-7
Ammonium carbonate	Sigma-Aldrich	506-87-6
Calcium chloride dihydrate	Merck KGaA	10035-04-8
Ethanol Absolute	Gadot	64-17-5
Micro-Raman	Renishaw		inVia Reflex spectrometer coupled with an upright Leica optical microscope
Microscope	Nikon		Eclipse 90i model
Nis elements Br software	Nikon		For microscope imaging
Scanning Electron Microscope	ThermoFisher Scientific		FEI Sirion microscope
Spectrophotometer	JASCO		V-670 model
Sputter coater	Polaron		SC7640 model