Formazione carbonato di calcio in presenza di additivi biopolimerici

Summary

Descriviamo un protocollo per la precipitazione e la caratterizzazione di cristalli di carbonato di calcio che si formano in presenza di biopolimeri.

Abstract

La biomineralizzazione è la formazione di minerali in presenza di molecole organiche, spesso correlate a ruoli funzionali e/o strutturali negli organismi viventi. Si tratta di un processo complesso e quindi è necessario un sistema semplice, in vitro, per comprendere l’effetto delle molecole isolate sul processo di biomineralizzazione. In molti casi, la biomineralizzazione è diretta da biopolimeri nella matrice extracellulare. Per valutare l’effetto dei biopolimeri isolati sulla morfologia e la struttura della calcite in vitro, abbiamo utilizzato il metodo di diffusione del vapore per la precipitazione del carbonato di calcio, la microscopia elettronica a scansione e il micro Raman per la caratterizzazione, e assorbimento visibile all’ultravioletto (UV/Vis) per misurare la quantità di un biopolimero nei cristalli. In questo metodo esponiamo i biopolimeri isolati, disciolti in una soluzione di cloruro di calcio, in ammoniaca gassosa e anidride carbonica che derivano dalla decomposizione del carbonato di ammonio solido. Nelle condizioni in cui viene raggiunto il prodotto di solubilità del carbonato di calcio, si formano precipitati e cristalli di carbonato di calcio. Il carbonato di calcio di calcio ha diversi polimorfi che differiscono nella loro stabilità termodinamica: carbonato di calcio amorfo, vaterite, aragonite e calcite. In assenza di biopolimeri, in condizioni pulite, il carbonato di calcio è presente principalmente nella forma di calcite, che è il polimorfo più termodinamicamente stabile del carbonato di calcio. Questo metodo esamina l’effetto degli additivi biopolimerici sulla morfologia e la struttura dei cristalli di carbonato di calcio. Qui, dimostriamo il protocollo attraverso lo studio di una proteina batterica extracellulare, TapA, sulla formazione di cristalli di carbonato di calcio. In particolare, ci concentriamo sull’impostazione sperimentale e sui metodi di caratterizzazione, come la microscopia ottica ed elettronica e la spettroscopia Raman.

Introduction

La biomineralizzazione è la formazione di minerali in presenza di molecole organiche, spesso correlate a ruoli funzionali e/o strutturali negli organismi viventi. La biomineralizzazione può essere intracellulare, come nella formazione di magnetite all’interno di batteri magnetotattici¹, o extracellulare, come nella formazione di carbonato di calcio nei picchi di riccio di mare², di idrossiapatite che è correlato con collagene in ossa³ e di smalto che è associato con amelogenin adenti⁴. La biomineralizzazione è un processo complesso che dipende da molti parametri nell’organismo vivente. Pertanto, al fine di semplificare il sistema in esame, è necessario valutare l’effetto di componenti separati sul processo. In molti casi, la biomineralizzazione è indotta dalla presenza di biopolimeri extracellulari. Lo scopo del metodo qui presentato è il seguente: (1) Formare cristalli di carbonato di calcio in presenza di biopolimeri isolati in vitro, utilizzando un metodo di diffusione del vapore. (2) Studiare l’effetto dei biopolimeri sulla morfologia e la struttura del carbonato di calcio.

Tre metodi principali per precipitare carbonato di calcio in vitro in presenza di additivi organici sono utilizzati^5,6. Il primo metodo, che ci riferiremo come il metodo della soluzione, si basa sulla miscelazione di un sale solubile di calcio (ad esempio, CaCl₂) con un sale di carbonato solubile (ad esempio, carbonato di sodio). Il processo di miscelazione può essere eseguito in diversi modi: all’interno di un reattore con tre cellule separate da membrane porose⁷. Qui, ciascuna delle cellule esterne contiene un sale solubile e la cella centrale contiene una soluzione con l’additivo da testare. Calcio e carbonato si diffondono dall’esterno alla cellula centrale, causando la precipitazione del carbonato di calcio meno solubile quando le concentrazioni di calcio e carbonato superano il loro prodotto di sobrietà, K_sp ^2-]. Un ulteriore metodo di miscelazione è la procedura a doppio getto⁸. In questo metodo, ogni sale solubile viene iniettato da una siringa separata a una soluzione mescolata contenente l’additivo, dove precipita il carbonato di calcio. Qui, l’iniezione e quindi il tasso di miscelazione è ben controllato, in contrasto con il metodo precedente in cui la miscelazione è controllata dalla diffusione.

Il secondo metodo utilizzato per cristallizzare CaCO₃ è il metodo Kitano⁹. Questo metodo si basa sull’equilibrio carbonato/idrogeno carbonato (2HCO₃^– _(aq) – Ca^2′_(aq) CaCO 3_(s) – CO 2_(g) – H₂O _(l)). Qui, CO₂ viene bollato in una soluzione contenente CaCO₃ in una forma solida, spostando l’equilibrio a sinistra e quindi sciogliendo il carbonato di calcio. Il carbonato di calcio non disciolto viene filtrato e gli additivi desiderati vengono aggiunti alla soluzione ricca di bicarbonato. Co₂ è quindi lasciato evaporare, spostando così la reazione a destra, formando carbonato di calcio in presenza degli additivi.

Il terzo metodo di cristallizzazione carbonata di calcio, che descriveremo qui, è il metodo di diffusione del vapore¹⁰. In questo set-up, l’additivo organico, sciolto in una soluzione di cloruro di calcio, viene posto in una camera chiusa vicino al carbonato di ammonio in forma di polvere. Quando la polvere di carbonato di ammonio si decompone in anidride carbonica e ammoniaca, si diffondono nella soluzione contenente ioni di calcio (ad esempio, CaCl₂), e il carbonato di calcio è precipitato (vedere la figura 1 a illustrazione). I cristalli di carbonato di calcio possono crescere da precipitazioni lente o da precipitazioni veloci. Per la lenta precipitazione, una soluzione contenente l’additivo nella soluzione CaCl₂ viene posta in un desiccatore accanto alla polvere di carbonato di ammonio. Nella precipitazione veloce, descritta in lunghezza nel protocollo, sia la soluzione additiva che il carbonato di ammonio vengono posizionati più vicini in una piastra multi-bene. Il metodo di precipitazione lenta produrrà meno centri di nucleazione e cristalli più grandi, e la precipitazione veloce si tradurrà in più centri di nucleazione e cristalli più piccoli.

I metodi sopra descritti differiscono nella loro complessità tecnica, nel livello di controllo e nella velocità del processo di precipitazione. Il metodo di miscelazione richiede un set-up speciale⁶ sia per il doppio getto che per il sistema a tre celle. Nel metodo di miscelazione, la presenza di altri controioni solubili (ad es., Na^,Cl^–)⁶ è inevitabile, mentre nel metodo Kitano, il calcio e il (bi) carbonato sono gli unici ioni in soluzione e non comporta la presenza di ulteriori ioni contatore (ad es., Na^,Cl^–). Inoltre, il metodo di miscelazione richiede volumi relativamente grandi e quindi non è adatto per lavorare con biopolimeri costosi. Il vantaggio del doppio getto è che è possibile controllare la velocità di iniezione della soluzione e che si tratta di un processo rapido rispetto ad altri metodi.

Il vantaggio del metodo Kitano e del metodo di diffusione del vapore è che la formazione di carbonato di calcio è controllata dalla diffusione di CO₂ in una soluzione CaCl_2, permettendo così di sondare processi di nucleazione e precipitazioni più lenti ^{11 Del} sistema di ^{, 12}. Inoltre, la formazione di carbonato di calcio per diffusione di CO₂ può assomigliare ai processi di calcificazione in vivo^13,14,15. In questo metodo, i cristalli ben definiti e separati sono formati¹⁶. Infine, è possibile testare l’effetto di biopolimeri singoli o multipli sulla formazione di carbonato di calcio. Ciò consente uno studio sistematico dell’effetto di una serie di concentrazioni additive sulla formazione di carbonato di calcio, nonché uno studio di miscele di biopolimeri – il tutto eseguito in modo controllato. Questo metodo è adatto per l’uso con una vasta gamma di concentrazioni e volumi di additivi. Il volume minimo utilizzato è di circa 50 gradi e quindi questo metodo è vantaggioso quando c’è una quantità limitata di biopolimeri disponibili. Il volume massimo dipende dall’accessibilità di un pozzo più grande o dal desiccatore in cui devono essere inseriti la piastra o il becher contenente CaCl 2. Il metodo descritto di seguito è stato ottimizzato per lavorare in una piastra di 96 pozze con un biopolimero scelto per essere la proteina TapA¹⁷.

Protocol

1. Cristallizzazione carbonata di calcio di calcio Preparazione e ottimizzazione dei controlli Preparare pezzi di vetro puliti. Utilizzare la stessa procedura di pulizia per pulire la vetreria. Utilizzare una penna a diamante per tagliare pezzi di un vetrino del microscopio in vetro in modo che si adattino in un pozzo di una piastra di 96 pozzetti.NOTA: i pezzi da 5 mm x 5 mm devono adattarsi in gran parte. Mettere i pezzi di vetro in un becher con tripla acqua …

Representative Results

Uno schema del set up sperimentale è illustrato nella Figura 1. In breve, il metodo di diffusione viene utilizzato per formare cristalli di carbonato di calcio in piastre di 96 pozze e testare l’effetto dei biopolimeri sulla morfologia e la struttura dei cristalli di carbonato di calcio. In questi esperimenti, il carbonato di ammonio viene decomposto in ammoniaca e CO2, che si diffondono in soluzioni di carbonato di calcio, con conseguente formazione di cristalli di carbonato di …

Discussion

Il metodo qui descritto è volto a formare cristalli di carbonato di calcio in presenza di additivi organici e a valutare l’effetto dei biopolimeri organici sulla morfologia e la struttura dei cristalli di carbonato di calcio in vitro. Il metodo si basa sul confronto dei cristalli formati in presenza degli additivi organici ai cristalli di calcite formati nell’esperimento di controllo. Abbiamo dimostrato come utilizzare il metodo di diffusione per formare i cristalli di carbonato di calcio, come caratterizzare la loro mo…

Materials

Acetic acid	Gadot	64-19-7
Ammonium carbonate	Sigma-Aldrich	506-87-6
Calcium chloride dihydrate	Merck KGaA	10035-04-8
Ethanol Absolute	Gadot	64-17-5
Micro-Raman	Renishaw		inVia Reflex spectrometer coupled with an upright Leica optical microscope
Microscope	Nikon		Eclipse 90i model
Nis elements Br software	Nikon		For microscope imaging
Scanning Electron Microscope	ThermoFisher Scientific		FEI Sirion microscope
Spectrophotometer	JASCO		V-670 model
Sputter coater	Polaron		SC7640 model