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Bioengineering

Vivo में दो रंग 2-फोटो त्वचा में आनुवंशिक रूप से टैग ्डकी गई रिपोर्टर कोशिकाओं की इमेजिंग

Published: July 11, 2019 doi: 10.3791/59647
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1School of Brain and Behavioral Science, Center for Advanced Pain Studies, University of Texas at Dallas

Summary

Morphological परिवर्तन सक्रियण के बाद प्रतिरक्षा उत्तरदायी फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं में होते हैं और सेलुलर भर्ती में परिवर्तन को बढ़ावा देने के. एक आनुवंशिक रूप से इंजीनियर Fibroblast-विशिष्ट प्रोटीन 1 (FSP1)-cre के साथ संयोजन के रूप में 2-फोटोन इमेजिंग का उपयोग; tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB) माउस लाइन और हरे रंग की फ्लोरोसेंटी टैग्ड lipopolysaccharide-FITC, हम dermal फाइब्रोब्लास्ट्स में lipopolisacride के अत्यधिक विशिष्ट तेज वर्णन कर सकते हैं और विवो में रूपात्मक परिवर्तन.

Abstract

फाइब्रोब्लास्ट्स मेसेनकाइमल कोशिकाएं हैं जो सक्रियण पर अपनी आकृति विज्ञान को बदलती हैं, अंततः उन ऊतक के सूक्ष्म पर्यावरण को प्रभावित करती हैं जो वे स्थित हैं। हालांकि पारंपरिक इमेजिंग तकनीक निश्चित ऊतक में प्रोटीन बातचीत और आकृति विज्ञान की पहचान करने में उपयोगी होते हैं, वे कैसे जल्दी से कोशिकाओं को बाँध और प्रोटीन को आगे ले जाने में सक्षम हैं के रूप में अंतर्दृष्टि देने में सक्षम नहीं हैं, और एक बार सक्रिय कैसे उनकी आकृति विज्ञान में परिवर्तन Vivo. वर्तमान अध्ययन में, हम 2 प्रमुख प्रश्न पूछते हैं: 1) टोल की तरह रिसेप्टर-4 (TLR4) और lipopolysaccharide (LPS) बातचीत और 2) कैसे इन कोशिकाओं को एक बार सक्रिय व्यवहार करते हैं के माध्यम से फाइब्रोब्लास्ट सक्रियण के समय पाठ्यक्रम क्या है? 2-फोटोन इमेजिंग का उपयोग करना, हम एक उपन्यास तकनीक एलपीएस-FITC की क्षमता का आकलन करने के लिए अपने cognate रिसेप्टर के लिए बाध्य करने के लिए विकसित किया है, TLR4, आनुवंशिक रिपोर्टर माउस लाइन में परिधीय फाइब्रोब्लास्ट पर व्यक्त; FSP1cre; वीवो में tdTomatolox-स्टॉप-लोक्स। इस अनूठी दृष्टिकोण शोधकर्ताओं में गहराई से बनाने के लिए अनुमति देता है, समय चूक वीडियो और / या प्रोटीन की तस्वीरें लाइव कोशिकाओं के साथ बातचीत है कि एक कैसे प्रोटीन सेलुलर व्यवहार को बदल सकते हैं समझने में दानेदारता का एक बढ़ा स्तर है करने के लिए अनुमति देता है.

Introduction

लिपोपॉलीसैकराइड (एलपीएस) एक एंडोटॉक्सिन है जो ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया1की बाहरी झिल्ली में पाया जाता है। एलपीएस टोल की तरह रिसेप्टर 4 (TLR4)/CD14/MD2 रिसेप्टर परिसर2के लिए एक उच्च बाध्यकारी संबंध है. TLR4 एक पैटर्न मान्यता रिसेप्टर आमतौर पर प्रतिरक्षा कोशिकाओं की एक विस्तृत श्रृंखला की बाहरी झिल्ली पर पाया जाता है, mesenchymal कोशिकाओं, और संवेदी न्यूरॉन्स का एक सबसेट3,4,5. प्रतिरक्षा कोशिकाओं पर व्यक्त TLR4 के सक्रियण MyD88 पर निर्भर है और स्वतंत्र दूसरे दूत प्रणाली की ओर जाता है, परमाणु कारक kappa बीटा (NF $B) सेल के नाभिक के लिए स्थानांतरण के साथ समाप्त होता है. यह प्रोटोटाइपिक प्रतिरक्षा कोशिका का उत्पादन और जारी करने के लिए इस तरह के Interleukin के रूप में समर्थक भड़काऊ cytokins (आईएल)-1 $, आईएल -6, और TNF-जेड6का कारण बनता है। हालांकि, कैसे अन्य कक्ष-प्रकार TLR4 उत्तेजना के लिए प्रतिक्रिया के रूप में स्पष्ट नहीं है। फाइब्रोब्लास्ट्स को कैंसर और सिस्टिक फाइब्रोसिस जैसे रोगों की एक विस्तृत श्रृंखला में फंसाया गया है और हाल ही में एक भूमिका मोनोसाइट कीमो-आकर्षण और सूजन को बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया है7,8,9.  हमारी प्रयोगशाला तीव्र और पुराने दर्द के विकास में फाइब्रोब्लास्ट्स की भूमिका में रुचि रखता है, जैसा कि प्रारंभिक सबूत से पता चलता है कि फाइब्रोब्लास्ट्स (मैट्रिक्स मेटलोप्रोटीनेस (एमएमपी), मेटलोप्रोटीनेज (टीएमपी) के ऊतक अवरोधक (TIMPs), और फाइब्रोब्लास्ट द्वारा जारी किए गए कारक वृद्धि कारक (FGFs) neuropathic दर्द10 में शामिल हैं.

कोशिकाओं के सक्रियण राज्यों में शामिल हैं कि कारकों की एक किस्म से निर्धारित किया जा सकता है: तत्काल प्रारंभिक जीन को शामिल करने, परिवर्तित प्रोटीन अभिव्यक्ति, सेल प्रसार, और रूपात्मक परिवर्तन11,12,13. वहाँ कई तकनीकों है कि सवालों के जवाब हम कैसे कोशिकाओं के सक्रियण रोगों के लिए योगदान देता है के बारे में हो सकता है मौजूद हैं, लेकिन वे सब अपनी सीमाएं हैं. प्रोटोटाइपिक इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री निश्चित ऊतक में ब्याज के प्रोटीन को लेबल करने के लिए फ्लोरोसेंटरूप टैग किए गए एंटीबॉडी का उपयोग करता है, जो विशिष्ट हो सकता है और अक्सर उपयोगी परिणाम देने से पहले महत्वपूर्ण समस्या निवारण की आवश्यकता होतीहै 14। पश्चिमी सोख्ता एक उपयोगी तकनीक है जब पोस्टमार्टम ऊतक में प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर की तुलना; तथापि, इस तकनीक में हिस्टोलॉजिकल घटक की कमी है और शोधकर्ता आकारिकी15में किसी भी परिवर्तन की पहचान करने में असमर्थ हैं। आरएनए-सेक हमें एक नमूने में दूत आरएनए की उपस्थिति की मात्रा निर्धारित करने की अनुमति देता है जो कई मामलों में व्यावहारिक डेटा प्राप्त करता है; तथापि, प्रतिलेखन और अनुवाद के बीच के अंतर के कारण उत्तेजना16के बाद लौकिक संकल्प करना कठिन हो जाता है। Confocal इमेजिंग 17 ऊतकों के एक पार अनुभाग में मौजूद है किप्रोटीन की अभिव्यक्ति और सह स्थानीयकरण का निर्धारण करने में उपयोगी है. अक्सर, यह ऊतक नमूने की संपूर्णता का प्रतिनिधि नहीं है। इसके विपरीत, multiphoton माइक्रोस्कोप उपयोगकर्ताओं को एक नमूना में लगभग 1 मिमी गहरी छवि के लिए अनुमति देते हैं, एक व्यापक तीन आयामी प्रतिनिधित्व18बनाने. इसलिए, हम विवोमें पर ध्यान केंद्रित करने के लिए चुनते हैं, 2-फोटोन इमेजिंग preps, के रूप में इन प्रयोगों से एकत्र डेटा और अधिक सीधे रहने वाले ऊतक के अत्यधिक प्लास्टिक और परस्पर microenvironment के लिए relatable हैं.

विवो में प्रोटीन-रिसेप्टर बातचीत का अध्ययन करने का एक लाभ यह है कि हम स्पष्ट रूप से कब्जा कर सकते हैं कि कैसे कोशिकाओं को एक उत्तेजना के लिए प्रतिक्रिया, वास्तविक समय, उनके मूल वातावरण में पोस्ट-मॉर्टम ऊतक निष्कर्षण19के हानिकारक और अप्रत्याशित प्रभाव के बिना . इसके अलावा, अनुदैर्घ्य अध्ययन सेलुलर plasticity और प्राइमिंग कि सक्रियण की वजह से हो सकता है का आकलन करने के लिए किया जा सकता है.  2-फोटोन इमेजिंग का उपयोग करके, हम जब कोई बाह्य उद्दीपक लागू किया जाता है तो हम उपस्थित सूक्ष्म पर्यावरण की अखंडता को सुरक्षित रखते हैं। इस प्रोटोकॉल फाइब्रोब्लास्ट्स में अणुओं के तेज की पहचान करने के लिए एक तरीका प्रदान करता है फ्लोरोब्लास्ट ्स्स के परिधीय इंजेक्शन के बाद फ्लोरोसेंटटैग ्डमेंटल एलपीएस में कई घंटों के दौरान विवो में और फाइब्रोब्लास्ट सक्रियण में TLR4 की भूमिका.

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Protocol

पशु प्रक्रियाओं डलास संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति में टेक्सास विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के दिशा निर्देशों के अनुसार थे.  सभी प्रयोगों का उपयोग किया गया 8-12 सप्ताह पुराने पुरुष और मादा चूहों एक C57BL/6 पृष्ठभूमि पर घर में नस्ल. फाइब्रोब्लास्ट-विशिष्ट प्रोटीन-1 प्रमोटर द्वारा संचालित cre-recombinase के साथ ट्रांसजेनिक चूहों वाणिज्यिक रूप से खरीदे गए थे (जैक्सन, 012641) (FSP1cre)+/- और tdTomatolox-stop-lox चूहों के साथ पार, भी व्यावसायिक रूप से खरीदा ( जैक्सन, 007914) और (FSP1cre)+/ tdTomatolox-stop-lox और FSP1cre-/-; tdTomatolox-stop-lox चूहों को C57BL/6 पृष्ठभूमि पर घर में पैदा किया गया था (चित्र 1A,B,C)। फाइब्रोब्लास्ट-विशिष्ट प्रोटीन 1 एक अंतर्जात प्रोटीन है जो लगभग 72% फाइब्रोब्लास्ट पर व्यक्त किया जाता है और त्वचा ऊतक20में एक प्रभावी क्री ड्राइवर का प्रतिनिधित्व करता है। चूहे समूह रखे गए थे और भोजन और पानी के लिए विज्ञापन libitum का उपयोग दिया. कमरे का तापमान 21 डिग्री 2 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा गया था। जबकि हम 8-12 सप्ताह में पुरुष और मादा चूहों को पार कर C57BL/6 का इस्तेमाल किया, हम उम्र, लिंग, या आनुवंशिक पृष्ठभूमि multiphoton प्रयोगों को चलाने के लिए आवश्यक आवश्यकताओं पर विश्वास नहीं करते. प्रयोग के तुरंत बाद चूहे को गहराई से एनेस्थेटाइज किया गया और इच्छामृत्यु कर दी गई।

1. दवाओं की तैयारी

  1. बाँझ 1x पीबीएस (पीएच 7.4) में lipopolisaccharide-FITC (सामग्री की तालिकादेखें) का 5 डिग्री/20 डिग्री एल समाधान तैयार करें। पाइपिंग से पहले समाधान भर में एक समान एकाग्रता के लिए समरूप मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए न्यूनतम 30 सेकंड के लिए मध्यम तीव्रता पर स्टॉक समाधान भंवर (LPS एक चिपचिपा अणु है).।
    नोट: एक गिलास कंटेनर में एलपीएस जगह नहीं है, यदि संभव हो तो, सिलिकॉन microcentrifuge ट्यूबों का उपयोग करें. उपयोग होने तक बर्फ पर रखें।

2. इमेजिंग सेट-अप

  1. दो रंग इमेजिंग के लिए multiphoton प्रणाली सेट (सामग्री की तालिकादेखें)। यह दो अलग उत्तेजना लेज़रों के उपयोग की आवश्यकता है (सामग्री की तालिकादेखें), एक GFP/RFP फिल्टर घन सेट (सामग्री तालिका देखें), और एक 25x (1.05 एनए) पानी विसर्जन उद्देश्य (सामग्री की तालिकादेखें).
    नोट: उपयोगकर्ताओं को बेहतर वैकल्पिक setups और multiphoton माइक्रोस्कोप क्षमताओं के अनुरूप करने के लिए इन सेटिंग्स को बदल सकते हैं. ये प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले पैरामीटर हैं। विशिष्ट विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें.
  2. बहुफोटीन सूक्ष्मदर्शी के चरण पर एक स्टीरियोटैक्सिक उपकरण रखें (सामग्री की सारणीदेखें)। यह एक संज्ञाहरण वितरण मशीन से कनेक्ट करें (सामग्री की तालिकादेखें) यह सुनिश्चित करने के लिए कि प्रयोग की अवधि के लिए जानवरों को एनेस्थेटाइज किया गया है। माउस पंजा के लिए एक कनेक्शन बिंदु के रूप में उपकरण की सतह पर मैट काले कागज का एक टुकड़ा रखें।
  3. 512 डिग्री ग्राम x 512 उ के नियत स्कैन क्षेत्रफल के साथ गुंजयमान स्कैनर का चयन करें।
    नोट: एक गैल्वेनोमीटर स्कैनर का उपयोग कर इस प्रोटोकॉल में प्रयोग न करें। धीमी नमूना दर के कारण, अपरिहार्य है कि जानवर के श्वसन के कारण z-स्टैक समय चूक वीडियो में विरूपण हो जाएगा।
  4. GFP और आरएफपी, 930 एनएम और 1100 एनएम क्रमशः की उत्तेजना तरंगदैर्ध्य के लिए दो उत्तेजना लेज़रों धुन, और एक उद्देश्य के लिए दोनों उत्तेजना लेज़रों के प्रकाश पथ प्रत्यक्ष 690-1,050 एनएम की अनुमति 930 एनएम tuned उत्तेजना लेजर मुख्य स्कैनर और 1,100 एनएम-ट्यून किए गए लेजर को सीधे मुख्य स्कैनर में पारित करने के लिए परिलक्षित होना (चित्र2)।
    नोट: यह उपयोगकर्ता के सेटअप के आधार पर इन उत्तेजना तरंगदैर्ध्य को बदलने के लिए संभव है।
  5. FITC की लेजर शक्ति 5% और GFP को 20% करने के लिए सेट करें.
    नोट: यह सेटअप इन प्रयोगों में एक इष्टतम संकेत करने के लिए शोर अनुपात (SNR) प्रदान करता है. बहु-अकाली फोटो-मल्टीप्लायर ट्यूबों (पीएमटी) के माध्यम से सिग्नल का पता लगाएं; हालांकि, GaAsP डिटेक्टरों के बजाय बहुत उच्च संवेदनशीलता प्रयोगों में इस्तेमाल किया जा सकता है.
  6. आवारा प्रकाश के बिना अंधेरे परिस्थितियों में इमेजिंग के लिए कमरे को तैयार करें।

3. विवो इमेजिंग में

  1. माउस को संज्ञाहरण वितरण प्रणाली के प्रेरण कक्ष में रखें और माउस को गहरे संज्ञाहरण के नीचे रखने के लिए ऑक्सीजन की 2 L/min प्रवाह दर पर 5% आइसोफ्लुरेन (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करें।
    नोट: यह अत्यधिक प्रयोग के दौरान सभी उपयुक्त PPE पहनने के लिए सिफारिश की है.
    1. प्रयोग के दौरान संज्ञाहरण बनाए रखने के लिए एक नाक शंकु के उपयोग के साथ स्टीरियोटैक्सिक उपकरण के लिए माउस स्थानांतरण. isoflurane को 1.5%-2% तक कम करें और प्रवाह दर स्थिर रखें।
    2. दृढ़ता से ब्याज के क्षेत्र के लिए दोनों निकट और distal क्षेत्रों पर काले टेप के साथ काले कागज के एक टुकड़े को पिछले पंजा चिपका (यह छवि गुणवत्ता पर माउस श्वसन के प्रभाव को कम कर देता है), सुनिश्चित करें कि पंजा के प्लांटर सतह unobstructed और सामना करना पड़ रहा है उद्देश्य की ओर. सुनिश्चित करें कि माउस का सिर तंत्र से जुड़ी नाक शंकु के भीतर स्थिर है।
      नोट: प्रयोग के दौरान संकट या निर्जलीकरण के किसी भी लक्षण के लिए माउस की निगरानी करें और तदनुसार isoflurane समायोजित करें।
  2. पंजा के प्लांटर सतह पर बाँझ पानी आधारित स्नेहक (जेल, सामग्री की तालिकादेखें) की एक उदार राशि रखें और पंजा और उद्देश्य के बीच तरल का एक स्तंभ बनाने के लिए इसे करने के उद्देश्य को छूने।
  3. पंजा के dermal परत में ध्यान केंद्रित करने के लिए FITC उत्तेजना प्रकाश का प्रयोग करें. सुनिश्चित करें कि tdTomato टैग फाइब्रोब्लास्ट पर जारी रखने से पहले कल्पना कर रहे हैं (यह कदम छवि के लिए सही फोकल विमान का निर्धारण करने में महत्वपूर्ण है).
    नोट: पंजा की चर्म परत पंजा में लगभग 100-150 0 मीटर है।
  4. छवि दोनों 930 एनएम और 1100 एनएम tuned लेज़रों के साथ पिछले पंजा के प्लांटर सतह के ठीक नीचे स्थित कोशिकाओं के क्षेत्र और एक 15 मिनट के समय के बारे में प्राप्त 5-10 z-slices पर लगभग 1 $m प्रति टुकड़ा करने के लिए पर्यावरण का प्रतिनिधित्व स्थापित करने से पहले एलपीएस-FITC के साथ इंजेक्शन।
  5. माउस के पिछले पंजा पर 5 डिग्री/20 एल एल एल एल-फिटसी का एक इंट्राप्लांटर इंजेक्शन प्रदर्शन 25 डिग्री ग्लास हैमिल्टन सिरिंज का उपयोग करते हुए (सामग्री की तालिकादेखें) और 30G सुई (सामग्री की तालिकादेखें), पंजा की स्थिति को परेशान न करने के लिए देखभाल करना।
  6. छवि दोनों 930 एनएम और 1100 एनएम tuned लेज़रों के साथ पिछले पंजा के प्लांटर सतह के ठीक नीचे स्थित कोशिकाओं के एक क्षेत्र और लगभग 5-10 z-slys पर लगभग 1-10 z-slys के बारे में एक 60-120 मिनट के समय चूक प्राप्त करने के लिए कोशिकाओं द्वारा LPS-FITC के तेज की पहचान.

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Representative Results

शुरू में, हम पंजा की dermal परत में मौजूद सभी सेल प्रकार में एलपीएस-FITC के तेज कल्पना करने के क्रम में जंगली प्रकार चूहों के पीछे-पंजा में LPS-FITC इंजेक्शन. एक जंगली प्रकार माउस में पिछले पंजा तेज फ्लोरोसेंट-टैग्ड एलपीएस की dermal परत में कोशिकाओं के असंख्य देखने के बाद (वीडियो चित्र 1, 2), हम विशेष रूप से फाइब्रोब्लास्टकोंस को लक्षित करने की कोशिश की क्योंकि वे हमारे शोध में एक प्राथमिक ध्यान केंद्रित कर रहे हैं। एलपीएस-FITC के साथ इंजेक्शन जानवरों के पंजे इमेजिंग से पहले हम स्पष्ट है कि dermal परत में कोशिकाओं की कोई अंतर्निहित फ्लोरोसेंट है चाहता था. यह सुनिश्चित करने के लिए है कि इंजेक्शन के बाद, हम ले छवियों फ्लोरोसेंट टैग एलपीएस और नहीं किसी भी इमेजिंग कलाकृतियों के साथ कोशिकाओं की सच्ची बातचीत कर रहे हैं (वीडियोचित्रा 3, 4). LPS-FITC इंजेक्शन के बाद, केवल FSP1+ फाइब्रोब्लास्ट्स TLR4 बाँध व्यक्त करने और इंजेक्शन प्रोटीन तेज, tdTomato टैग के साथ सह-स्थानीयकरण के एक उच्च स्तर के साथ इन कोशिकाओं द्वारा व्यक्त (वीडियोचित्रा 5). इसके विपरीत, चूहों कि TLR4 पूरे शरीर से बाहर खटखटाया (TLR4KO) बाँध नहीं है और इंजेक्शन के बाद LPS तेज. वीडियो में स्पष्ट रूप में, कोशिकाओं के silhouettes LPS-FITC इंजेक्शन जो इंगित करता है कि दवा कोशिकाओं के आसपास अंतरालीय तरल पदार्थ में dispersing है, लेकिन वास्तव में एक रिसेप्टर से बाध्य नहीं किया जा रहा है के बाद दिखाई दे रहे हैं (वीडियोचित्रा 6).

हमारे परिणामों को संक्षेप में प्रस्तुत करने के लिए, हम दिखाते हैं, विवो में, कि LPS-FITC के इंजेक्शन के बाद, एक FSP1cre में; tdTomatolox-stop-lox सेल-विशिष्ट पुनः सक्रिय पशु केवल फाइब्रोब्लास्ट्स के साथ बातचीत और एलपीएस तेज। इसके विपरीत, TLR4 के पूरे शरीर knockouts बाँध नहीं है और इंजेक्शन के बाद LPS-FITC तेज.

Figure 1
चित्र 1 tdTomato केवल FSP1+ Fibroblasts में एक क्रे-डिडेंट मैनर में व्यक्त किया जाता है। ए) FSP1cre ट्रांसजेनिक चूहों एक C57BL/6 पृष्ठभूमि पर नस्ल tdTomato चूहों के साथ पार कर रहे हैं एक C57BL/6 पृष्ठभूमि पर नस्ल चूहों FSP1 में tdTomato व्यक्तउत्पन्न करने के लिए + फाइब्रोब्लास्ट एक cre-निर्भर फैशन में. बी)प्रतिनिधि पीसीआर परिणाम दोनों सकारात्मक और नकारात्मक FSP1cre चूहों tdTomato व्यक्त चित्रण. सी) माउस पंजा में स्थित extracellular अंतरिक्ष में dermal फाइब्रोब्लास्ट्स के प्रतिनिधि चित्रलेख. FSP1+ चूहों केवल फाइब्रोब्लास्ट्स में एक लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करते हैं, जबकि FSP1- चूहों नहीं है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 . दो रंग 2-फोटोन माइक्रोस्कोप का प्रकाश पथ। 2-रंग 2-फोटोन प्रयोग सेट अप के लिए सेट किए गए प्रकाश पथ का चित्रण. लेजर 1 FITC-संयुग्मी एलपीएस उत्तेजित करने के लिए 930 एनएम करने के लिए देखते है और लेजर 2 फाइब्रोब्लास्ट में पाया tdTomato उत्तेजित करने के लिए 1100 एनएम करने के लिए tuned है। लेजर 1 से उत्तेजना प्रकाश dichroic दर्पण (690-1050 एनएम) द्वारा परिलक्षित होता है, जबकि लेजर 2 से उत्तेजना प्रकाश मुख्य स्कैनर के माध्यम से गुजरता है। दोनों पराबैंगनीकिरण से प्रकाश एक दूसरे dichroic दर्पण (650 एनएम) के लिए दर्पण का एक सेट द्वारा परिलक्षित होता है उत्तेजना प्रकाश उद्देश्य के माध्यम से पारित करने के लिए और ऊतक में fluorores उत्तेजित करने के लिए अनुमति देता है. प्रकाश उत्तेजित फ्लोरोफोर्स से उत्सर्जित होता है और 25x उद्देश्य द्वारा कब्जा कर लिया जाता है और डाइक्रोइक दर्पण (650) द्वारा बहु-अल्कली फोटोगुणी ट्यूबों को परिलक्षित होता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 . 2-फोटोमाइक्रोस्कोपी का प्रायोगिक प्रवाह चार्ट। चूहे एक कम प्रवाह संज्ञाहरण प्रणाली और stereotaxic तंत्र का उपयोग कर एनेस्थेटाइज़ और स्थिर कर रहे हैं। पंजा के प्लांटर सतह उद्देश्य का सामना करना पड़ता है और 15 मिनट के लिए छवि है। एनेस्थेटाइज्ड माउस पर 5 ग्राम/20 एल एल एल-एफपीएस-फिटसी का इंट्राप्लांटर इंजेक्शन किया जाता है और प्रयोग के लक्ष्य के लिए आवश्यक समय की अवधि के लिए पंजा लगाया जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Video Figure 1
वीडियो चित्र 1. जंगली प्रकार C57BL/6 चूहे में कोशिकाओं में एलपीएस-FITC के जेड-स्टैक वीडियो तेज। एलपीएस-FITC इंजेक्शन से पहले एक C57BL/6 माउस के पिछले पंजा के dermal परत के जेड-स्टैक वीडियो। एक जंगली प्रकार माउस पंजा के plantar पहलू LPS-FITC के साथ इंजेक्शन से पहले 15 मिनट के लिए छवि की गई थी GFP चैनल में उत्पादित autofluorsc के लिए नियंत्रित करने के लिए. कोई autofluorscence का संकेत GFP चैनल में कोई संकेत करने के लिए थोड़ा है. कृपया यहाँ क्लिक करें इस वीडियो को देखने के लिए. (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Video Figure 2
वीडियो चित्र 2. एलपीएस-FITC इंजेक्शन के बाद एक C57BL/6 माउस के पिछले पंजा के dermal परत के जेड-स्टैक वीडियो। एक जंगली प्रकार माउस पंजा के plantar पहलू TLR4 व्यक्त सभी कोशिकाओं द्वारा एलपीएस-FITC के तेज कल्पना करने के लिए 1.5 घंटे के बाद LPS-FITC इंजेक्शन के लिए छवि थी. वीडियो में स्पष्ट रूप से, कोशिकाओं की एक भीड़ बाँध और प्रयोग के दौरान LPS-FITC आगे. कृपया यहाँ क्लिक करें इस वीडियो को देखने के लिए. (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Video Figure 3
वीडियो चित्र 3. एक FSP1cre के पिछले पंजा के dermal परत के जेड-स्टैक वीडियो; LPS-FITC इंजेक्शन से पहले tdTomato माउस. एक FSP1cre के प्लांटर पहलू; tdTomato माउस पंजा 15 मिनट के लिए LPS-FITC के साथ इंजेक्शन से पहले के लिए छवि थी GFP चैनल में उत्पादित autofluorence के लिए नियंत्रित करने के लिए. कोई autofluorscence का संकेत GFP चैनल में कोई संकेत करने के लिए थोड़ा है. tdTomato-सकारात्मक फाइब्रोब्लास्ट्स कल्पना कर रहे हैं. कृपया यहाँ क्लिक करें इस वीडियो को देखने के लिए. (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Video Figure 4
वीडियो चित्र 4. एलपीएस-FITC इंजेक्शन से पहले एक TLR4KO माउस के पिछले पंजा के dermal परत के जेड-स्टैक वीडियो. TLR4KO माउस पंजा के plantar पहलू LPS-FITC के साथ इंजेक्शन से पहले 15 मिनट के लिए छवि थी GFP चैनल में उत्पादित autofluorsc के लिए नियंत्रित करने के लिए. कोई autofluorscence का संकेत GFP चैनल में कोई संकेत करने के लिए थोड़ा है. कृपया यहाँ क्लिक करें इस वीडियो को देखने के लिए. (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Video Figure 5
वीडियो चित्र 5. एक FSP1cre के पिछले पंजा के dermal परत के जेड-स्टैक वीडियो; LPS-FITC इंजेक्शन के बाद tdTomato माउस|  एक FSP1cre के प्लांटर पहलू; tdTomato माउस पंजा TLR4 व्यक्त द्वारा एलपीएस-FITC के तेज कल्पना करने के लिए 1.5 घंटे के बाद एलपीएस-FITC इंजेक्शन के लिए छवि थी। वीडियो में स्पष्ट रूप से, TLR4 के माध्यम से एलपीएस-FITC के अत्यधिक विशिष्ट तेज tdTomato-सकारात्मक फाइब्रोब्लास्ट्स पर व्यक्त देखा जाता है. कृपया यहाँ क्लिक करें इस वीडियो को देखने के लिए. (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Video Figure 6
वीडियो चित्र 6. एलपीएस-FITC इंजेक्शन के बाद एक TLR4KO माउस के पिछले पंजा के dermal परत के जेड-स्टैक वीडियो.  TLR4KO माउस पंजा के plantar पहलू TLR4 की एक पूरी शरीर नॉकआउट में कोशिकाओं द्वारा LPS-FITC के तेज संभव है अगर कल्पना करने के लिए 1.5 घंटे के बाद LPS-FITC इंजेक्शन के लिए छवि थी. वीडियो में स्पष्ट रूप से, एलपीएस-एफआईटीसी का कोई तेज पिछले पंजा की dermal परत में सेल द्वारा देखा जाता है. कृपया यहाँ क्लिक करें इस वीडियो को देखने के लिए. (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

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Discussion

यकीनन विवो 2-फोटोन इमेजिंग में का सबसे महत्वपूर्ण कदम हैं: 1) बहु-फोटोन सेटअप और प्रयोगात्मक जरूरतों के लिए सही आनुवंशिक रिपोर्टर माउस और फ्लोरोसेंट-टैग प्रोटीन का चयन21,22; 2) ऊतक23में कोशिकाओं की आबादी का सही प्रतिनिधित्व करने के लिए सही फोकल विमान इमेजिंग; 3) एक अनुचित तरीके से स्थिर पशु24के कारण आंदोलन को कम करने; और 4) यह चुनना कि डेटा का गुणात्मक विश्लेषण कब किया जाए बनाम मात्रात्मक रूप से25,26,27. एक प्रयोग शुरू करने से पहले इन बिंदुओं को संबोधित करने के लिए सुनिश्चित करने के लिए डेटा है कि दोनों reproduible और वैज्ञानिक रूप से कठोर है इकट्ठा करने के लिए ज्ञान प्रदान करेगा.

प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण विचार ठीक से छवि वाले क्षेत्र को स्थिर कर रहा है। पशु से श्वसन इमेजिंग के दौरान फोकल विमान में मिनट बदलाव का कारण बनता है और जब z-स्टैक और समय चूक वीडियो प्रदर्शन, इस वीडियो में महत्वपूर्ण विरूपण का कारण बनता है और नकारात्मक उत्पादित डेटा की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकते हैं. यह सुनिश्चित करना कि पंजा ठीक से स्थिर है श्वसन से व्यवधान के बिना पंजा के सफल इमेजिंग की अनुमति देगा। इसके अलावा, प्रयोग में कोशिकाओं के स्थानीयकरण जानने के लिए कल्पना करने के लिए सही फोकल विमान की पहचान करने में एक महत्वपूर्ण कदम है. क्योंकि हम dermal फाइब्रोब्लास्ट्स पर ध्यान केंद्रित करने के लिए चुना है, हम केवल पंजा में एक अपेक्षाकृत कम दूरी छवि के लिए ब्याज के हमारे सेल प्रकार की कल्पना करने में सक्षम होने की जरूरत है ($100-150 $m). अन्य प्रयोगों में, यह माइक्रोस्कोप और उद्देश्य एक का उपयोग करता है की क्षमताओं पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि ऊतक के भीतर गहरी छवि कोशिकाओं के लिए एक प्रयोग प्रदर्शन असंभव के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है उपयोगकर्ताओं की स्थापना की.  अंत में, प्रयोग के अंतिम चरणों में डेटा विश्लेषण करने का तरीका चुनना एक महत्वपूर्ण विचार है. यहाँ, हम दिखा रहे हैं कि फाइब्रोब्लास्ट्स TLR4 व्यक्त करने के लिए आगे बढ़ ने और फ्लोरोसेंट टैग एलपीएस जो हरे रंग की मजबूत सह-स्थानीयकरण द्वारा स्पष्ट है बाँध कर रहे हैं (LPS) और लाल (tdTomato फाइब्रोब्लास्ट्स द्वारा व्यक्त) वीडियो में. हालांकि कोई मात्रात्मक छवि विश्लेषण इस प्रोटोकॉल में किया जाता है, वहाँ तरीके एक उपयोगकर्ता इस प्रोटोकॉल से एकत्र डेटा की व्याख्या कर सकता है की एक किस्म है. पहले एक साधारण सह स्थानीयकरण विश्लेषण किया जा रहा है एक दिया पिक्सेल28में दो अलग अलग रंग की तीव्रता को मापने के लिए खुला स्रोत सॉफ्टवेयर का उपयोग कर. यह उपयोगकर्ता की पहचान करने के लिए अगर दो उत्साहित fluorores एक अधिग्रहीत छवि या वीडियो में एक दिए गए पिक्सेल पर पाए जाते हैं और इस ओवरलैप का कितना वहाँ एक दिया अंतरिक्ष में है की अनुमति देता है. यह पहचान करने में उपयोगी है अगर ब्याज की कोशिकाओं इंजेक्शन अणु के साथ कुछ क्षमता के लिए बातचीत कर रहे हैं. मात्रात्मक विश्लेषण की एक वैकल्पिक विधि फ्लोरोसेंट तीव्रता29है। उपयोगकर्ता ब्याज की एक सेल के भीतर एक दिए गए संकेत की तीव्रता के बारे में जानकारी इकट्ठा करने में सक्षम है. इन विश्लेषणों से एकत्रित आंकड़ों से यह संकेत मिलता है कि कोशिकाएं दूसरों की तुलना में अणु की विभिन्न मात्रा में कैसे आगे बढ़ सकती हैं। डेटा विश्लेषण की ये विधियाँ इस बात का उदाहरण हैं कि उपयोगकर्ता इस प्रोटोकॉल में किए गए किसी प्रयोग से एकत्रित डेटा का विश्लेषण कैसे करना चाहता है.

हमारे आनुवंशिक मॉडल हमें चुनिंदा फ्लोरोसेंट टैग (tdTomato) FSP1+ एक cre/loxP-निर्भर तरीके से फाइब्रोब्लास्ट्स की अनुमति देते हैं, जो त्वचा के डर्मिस में कोशिकाओं के त्वरित और आसान दृश्य के लिए अनुमति देताहै। हालांकि यह उनके निहित फ्लोरोसेंट की वजह से कोशिकाओं visualizing आसान बनाता है, यह आनुवंशिक रूप से टैग कोशिकाओं के बिना 2-photon इमेजिंग का संचालन करने के लिए संभव है अगर उपयोगकर्ता त्वचा dermis से dermis के लिए बदलाव का निर्धारण करने में अनुभव किया है. त्वचा पर बालों से autofluorscence के मजबूत स्तर का उपयोग जहां उपयोगकर्ता ध्यान केंद्रित कर रहा है और दिशा एक वांछित फोकल विमान प्राप्त करने में स्थानांतरित करने की जरूरत का एक उपयोगी संकेत हो सकता है. यह स्पष्ट रूप से केवल काम अगर त्वचा के करीब में ब्याज की फोकल विमान और ब्याज की कोशिका ऊतक के भीतर गहरी है नहीं होगा.

प्रयोग के दौरान एक फोकल विमान ट्रैकिंग आदर्श है; हालांकि, एक जीवित जानवर के श्वसन के कारण, यह समय के साथ फ्रेम बदलाव को रोकने के लिए मुश्किल बनाता है जब एक समय चूक प्रयोग में z-स्टैक को शामिल. इस समस्या का निवारण करने के लिए, उपयोगकर्ता किसी गुंजयमान स्कैनर का उपयोग करते समय लाइन-औसत को कम करके और नमूना दर बढ़ाने से इमेजिंग गुणवत्ता को कम करने पर विचार कर सकते हैं। जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, एक प्रयोग में पारंपरिक गैल्वेनोमीटर स्कैनर का उपयोग करना लगभग असंभव है, जहां स्कैनर की धीमी नमूना दर के कारण एक z-स्टैक और समय-चूक को शामिल किया जाता है।

छवि प्राप्ति की अवधि बदलने से उपयोगकर्ता अपने प्रयोग की आवश्यकताओं के अनुरूप बेहतर हो सकता है. जबकि समय की विस्तारित अवधि के लिए पशु इमेजिंग उपयोगकर्ता अणु endocytosis और चयापचय के सभी चरणों में डेटा इकट्ठा करने के लिए अनुमति देता है, इस प्रक्रिया के केवल विशिष्ट भागों छवि के लिए समय छोटा दक्षता में वृद्धि होगी. यह समय की एक छोटी अवधि के लिए छवि के लिए संभव है ($1-15 मिनट) अणु लगाव की पहचान करने के लिए, समय की एक लंबी अवधि ($15-30 मिनट) रिसेप्टर-ligand endocytosis कल्पना करने के लिए30, और पूरी अवधि ($30-60 मिनट) सेलुलर कल्पना करने के लिए सक्रियण और अणु के संभावित चयापचय. यह इंजेक्शन लगाए गए अणु पर अत्यधिक निर्भर है और कोशिकाओं की कल्पना की गई थी (चित्र 3) ।

इस पांडुलिपि में वर्णित प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण नोट यह है कि वर्तमान में, हम पूर्व और बाद इंजेक्शन एक समान नमूना क्षेत्रों छवि करने में असमर्थ हैं. यह सेटअप की प्रकृति और दवा वितरण की विधि के कारण है। हालांकि, हम कई घंटे के लिए एक समय जल्दी बाद इंजेक्शन से कोशिकाओं को ट्रैक करने में सक्षम हैं. हालांकि यह प्रयोग के दौरान अलग-अलग कोशिकाओं का ट्रैक रखने के लिए महत्वपूर्ण है, सेलुलर सक्रियण में क्षेत्रीय बदलाव समान रूप से महत्वपूर्ण हैं और इस विधि का उपयोग कर कब्जा किया जा सकता है. एक बहुफोटन माइक्रोस्कोप पर एक साथ दो से अधिक फ्लोरोफोर्स कल्पना सेटअप दिया असंभव है, इसलिए, इस विधि की एक सीमा यह है कि उपयोगकर्ताओं को केवल अन्य इमेजिंग उपकरण के लिए विरोध के रूप में दो फ्लोरोफोर छवि करने में सक्षम हैं जहां 4 या अधिक फ्लोरोफोर एक साथ31कल्पना करने में सक्षम हैं। कुल मिलाकर, वर्णित प्रोटोकॉल हमारी प्रयोगशाला के लक्ष्यों के लिए विशिष्ट है और सेलुलर सक्रियण जहां प्रयोगात्मक संभावनाओं प्रोटोकॉल की सीमाओं पल्ला झुकना की पहचान करने में एक उपयोगी उपकरण प्रदान करता है.

इस पांडुलिपि में वर्णित विधियों कोशिकाओं के सक्रियण कल्पना करने के लिए मौजूदा तरीकों पर लाभ के एक नंबर प्रदान करते हैं. पहले जा रहा है कि प्रयोगों यहाँ प्रदर्शन vivo में हैं, कोशिकाओं बाध्यकारी और लेने अणुओं जो सीधे एक अपमान के संबंध में विशेष रूप से सक्रियण का संकेत है लेने के वास्तविक समय दृश्य के लिए अनुमति देता है. यह पारंपरिक लाइव-सेल इमेजिंग तकनीक जैसे अन्य तरीकों पर लाभ प्रदान करता है क्योंकि हम कोशिकाओं के पर्यावरण को संरक्षित करने में सक्षम हैं जो हाइपरexcitability और अस्थानिकता के कारण परिणामों को भ्रमित करने की संभावना को काफी कम कर देता है वियोजन के आघात से संबंधित कोशिकाओं की गतिविधि32| इसके अलावा, इस प्रयोगात्मक सेटिंग में एक multiphoton माइक्रोस्कोप का उपयोग दर जिस पर fluorfores फोटो ब्लीच निरंतर और काफी लंबे समय तक इमेजिंग सत्र के लिए अनुमति देता है कम हो जाती है जो महत्वपूर्ण है अगर उपयोगकर्ता अध्ययन करने के लिए इस विधि लागू होता है चयापचय या दीर्घकालिक सक्रियण33की दर की जांच . अंत में, यदि ब्याज के सेल प्रकार के ऊतक के भीतर गहरी रहते हैं (gt; 100 मिमी) एक multiphoton माइक्रोस्कोप का उपयोग इष्टतम संकेत प्राप्त करने के लिए आवश्यक है34. कुल मिलाकर, अगर एक उपयोगकर्ता के प्रयोग का लक्ष्य वास्तविक समय तेज और एक अपमान के जवाब में कोशिकाओं के सक्रियण का अध्ययन करने के लिए है तो ट्रांसजेनिक रिपोर्टर लाइनों के साथ मिलकर दो-फोटोमाइक्रोका का उपयोग कर अन्य पारंपरिक कल्पना तकनीकों पर अधिक उपयुक्त है.

इस तकनीक उपयोगकर्ताओं सक्रियण के संबंध में सेल प्रकार की एक विस्तृत विविधता पर अनुदैर्घ्य अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है, गतिशीलता, और सेल से सेल बातचीत. इस तकनीक का लाभ यह है कि यह उपयोगकर्ताओं के लिए अपने स्वयं के आनुवंशिक रूप से टैग की गई रिपोर्ट किए गए जानवरों का उपयोग करने और फ्लोरोसेंट टैग किए गए अणु को उनके अनुसंधान हितों के अनुरूप करने की अनुमति देता है (उदाहरण के लिए, उपकला कोशिकाओं के लिए Tie2cre)। इस प्रोटोकॉल हमारे प्रयोगों में दिखाया विशिष्ट सेटअप करने के लिए प्रतिबंधित नहीं है और अत्यधिक आनुवंशिक रिपोर्टर लाइनों और उनके अध्ययन में 2-photon dermal इमेजिंग का उपयोग किसी भी प्रयोगशाला की जरूरतों को फिट करने के लिए संशोधित किया जा सकता है. हम इस दृष्टिकोण का उपयोग करने के लिए सक्रियण और परिधीय आघात के बाद चोट की साइट के लिए प्रतिरक्षा कोशिकाओं की भर्ती की पहचान करने की योजना है और निर्धारित क्या सक्रियण और भर्ती के विशिष्ट समय पाठ्यक्रम इतना है कि हम बेहतर समझ सकते हैं कि सबसे अच्छा तरीका क्या है निवारक चिकित्सा के लिए दर्द के विभिन्न रूपों के संबंध में है.

अंत में, हम एक उपन्यास तकनीक है कि उपयोगकर्ताओं को tdTomato-टैग dermal फाइब्रोब्लास्ट्स TLR4 2-photon माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर व्यक्त द्वारा फ्लोरोसेंट-टैग्ड एलपीएस की छवि के लिए अनुमति देता है विकसित किया है.

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनका कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं है।

Acknowledgments

यह काम अनुदान NS096030 (एमडीबी) द्वारा समर्थित है। हम इमेजिंग कोर मैनेजर वेद प्रकाश को भी धन्यवाद देना चाहेंगे। हम भी उपकरण और समर्थन प्रदान करने के लिए यूटी डलास में ओलिंप डिस्कवरी सेंटर /

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x PBS, 4 L Fisherbrand BP3994
700 Series MICROLITER Syringes, Hamilton, Model 705 LT Syringe Hamilton 80501
BD Precision Glide Needle 30G VWR 305106
Blue Pad Fisherbrand 1420665
Filter Cube: Green/Red (BP 495-540 DM570 BP 575-645) Olympus FV30-FGR
Isoflurane, USP 250 mL Vedco 50989-150-15
Lipopolysaccharides from Escherichia Coli O111:B4 - FITC conjugate Sigma-Aldrich F3665-1MG
Main scanner laser: Spectra Physics INSIGHT DS+ -OL pulsed IR LASER, tunable from 680 nm to 1300 nm, 120 fs pulse width at specimen plane Spectra Physics
Micro Centrifuge Tubes, 1.5 mL VWR 20170-333
Multiphoton Microscope: Olympus MPE-RS TWIN Olympus MPE-RS TWIN
Objective: Ultra 25x MPE water-immersion objective 1.05 NA, 2 mm WD Olympus XLPLN25XWMP2
Personal Lubricant Jelly (Gel) equate ZH727 2E F1
SGM-4 Stereotaxic Apparatus Narishige 16030
SomnoSuite Low-Flow Anesthesia System Kent Scientific Corporation SS-01
Stimulation laser: Olympus-specific SPECTRA PHYSICS MAI TAI HP DEEP SEE-OL pulsed IR LASER, tunable from 690 nm to 1040 nm, 100 fs pulse width at specimen plane Spectra Physics

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Szabo-Pardi, T. A., Agalave, N. M., Andrew, A. T., Burton, M. D. In Vivo Two-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin. J. Vis. Exp. (149), e59647, doi:10.3791/59647 (2019).

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