Summary

Robust osufilazione modello di Murine Periodontitis per la valutazione dei neutrofili orali

Published: January 21, 2020
doi:

Summary

Questo articolo presenta un protocollo per stabilire un modello di parodontite indotta da legatura di parodontite murina che coinvolge molari maxillari multipli, con conseguente aree più grandi del tessuto gengivale e dell’osso coinvolti per l’analisi successiva, nonché l’uso ridotto degli animali. Viene descritta anche una tecnica per valutare i neutrofili orali in modo analogo ai soggetti umani.

Abstract

I principali vantaggi dello studio della fisiopatologia della malattia parodontale utilizzando modelli murini sono la riduzione del costo degli animali, la gamma di ceppi geneticamente modificati, il gran numero di analisi che possono essere eseguite su tessuti molli e duri raccolti. Tuttavia, molti di questi sistemi sono oggetto di critiche procedurali. In alternativa, può essere impiegato il modello di malattia parodontale indotta dalla legatura, guidata dallo sviluppo localizzato e dalla ritenzione di un microbioma orale disbiotico, che è rapidamente indotto e relativamente affidabile. Purtroppo, le varianti del protocollo di parodontite murina indotta dalla legatura sono isolate nelle regioni focali del parodonto e soggette ad avulsione prematura della legatura installata. Questo riduce al minimo la quantità di tessuto disponibile per le analisi successive e aumenta il numero di animali necessari per lo studio. Questo protocollo descrive le manipolazioni precise necessarie per inserire legature molare estese con una migliore ritenzione e l’uso di una nuova tecnica di risciacquo per recuperare i neutrofili orali nei topi con un approccio alternativo che mitiga i suddetti sfide tecniche.

Introduction

La malattia parodontale (PD) è una condizione osteolitica associata a una significativa morbilità dell’ospite e onere economico, che si manifesta con infiammazione gengivale e perdita sia dell’attaccamento dei tessuti molli che del supporto osseo per la dentizione interessata1,2,3,4. Questo processo è regolato dalle interazioni tra il microbiota orale e il sistema immunitario innato dell’ospite. È anche associato con esacerbazione di altre malattie infiammatorie sistemiche tra cui il diabete, malattie cardiovascolari, e il cancro5,6,7,8. Storicamente, è stato ipotizzato che la patogenesi della PD dipende da grandi quantità di batteri specifici come Porphyromonas gingivalis9. Tuttavia, prove recenti suggeriscono che la componente microbica della PD è mediata dal biofilm dentale. Il biofilm è una comunità organizzata e complessa di numerosi microrganismi che possono esistere in sani stati simbiotici e distruttivi disbiotici10,11. Il biofilm orale normalmente offre resistenza all’ospite impedendo la creazione di foci di batteri patogeni e promuove la struttura e la funzione del tessuto gengivale ideale attraverso la regolazione della risposta immunitaria dell’ospite12,13. Le perturbazioni della relazione equilibriosa tra gli organismi commensali all’interno della cavità orale e il sistema immunitario ospite possono portare ad alterazioni dell’omeostasi dei tessuti, con conseguente disbatteriosi e sviluppo del segno distintivo delle comparse cliniche e radiografiche di PD5,10,12,13,14.

È interessante notare che la creazione di una disbatteriosi orale, sebbene necessaria per l’avvio della PD, non è sufficiente per guidare la PD in tutti gli individui, eludendo verso la capacità della risposta immunitaria dell’ospite di sovvertire la transizione del microbiota tra stati simbiotici e disbiotici15. Questo pone un particolare riflettore sui mezzi attraverso i quali la PD influenza uno dei principali caratteri del sistema immunitario innato, vale a dire il granulocito polimorfonucleare (PMN), o neutrofilo, da prospettive locali e sistemiche16,17.

Nell’uomo, le PNN vengono reclutate dalla circolazione ad un tasso di 2 x 106 cellule/h nei tessuti connettivi parodontali sani, dove sono la popolazione di leucociti predominante. Qui, vengono successivamente espulsi dal solco gengivale nella cavità orale come componente del liquido crevicolare gengivale. In presenza della PD, la neutrofilia si manifesta all’interno della circolazione e della cavità orale, dove queste cellule eftori possiedono un fenotipo iperinfiammatorio che porta alla suddetta distruzione del parontium17,18,19,20,21,22. Pertanto, comprendere il ruolo delle PMN nella PD e in altre condizioni infiammatorie sistemiche è della massima importanza.

Anche se è ampiamente riconosciuto che le malattie croniche sono reciprocamente legate alla PD, i meccanismi sottostanti devono ancora essere chiariti, contribuendo a difficoltà nella gestione di queste condizioni sistemiche morbose e potenzialmente fatali. Diversi modelli animali sperimentali, ciascuno con vantaggi e svantaggi unici, sono stati utilizzati per studiare la fisiopatologia del PD23,24. Concentrandosi in particolare sui modelli murini, ci sono una varietà di protocolli attraverso i quali lo studio della PD è facilitato; tuttavia, essi possiedono diverse carenze tecniche e fisiologiche25,26,27,28,29,30,31.

In primo luogo, il modello di topo gavage orale richiede numerose inoculazioni orali di patogeni parodontali umani per generare infiammazione gengivale e perdita ossea. Inoltre, è generalmente preceduto da un periodo di trattamento antibiotico per sovvertire la flora orale murinacommensale 25. Questo modello spesso richiede una formazione specializzata per eseguire in modo sicuro il gavage orale, utilizza solo una piccola frazione di patogeni parodontali dal più complesso microbioma orale umano e richiede diversi mesi per stabilire la perdita ossea alveolare.

Al contrario, i modelli murini indotti chimicamente utilizzano la consegna orale di acido solforico trinitrobenzene (TNBS) o sodio solfato dextran (DSS), agenti comunemente utilizzati nella creazione di modelli murini di colite per un periodo di diversi mesi per indurre la perdita ossea periodoontale26. Sono disponibili modelli a base di ascesso intraorale ed extraorale, che coinvolgono rispettivamente gli incisivi murini e i tessuti del dorsum e il calvario. Nel modello precedente di ascesso, vengono somministrate diverse iniezioni di batteri, creando ascessi gingivali multipli e una carenza di perdita ossea alveolare, limitando il loro uso nello studio della PD. Questi ultimi modelli di ascesso sono significativamente più adatti allo studio della virulenza batterica, dell’infiammazione e del riassorbimento osseo in siti al di fuori della cavità orale, che elimina la valutazione del paroto e del microbioma orale27,28,29,30,31.

Utilizzando il modello indotto dalla legatura della parodontite, una sutura di seta intrecciata è stata comunemente installata ciferenzialmente intorno al secondo molare. In alternativa, è possibile inserire un singolo segmento lineare di materiale di sutura tra il primo e il secondo molari32,33. L’obiettivo del posizionamento della legatura è quello di facilitare l’accumulo batterico e generare disbiosi all’interno del sulci gengivale, con conseguente infiammazione del tessuto parodontale e distruzione dei tessuti che compongono il parodonto. In particolare, questo modello è in grado di produrre significativamente più perdita ossea alveolare rispetto al modello di gavage orale più comunemente usato34. A complicare ulteriormente l’uso del modello di gavage orale è la resistenza naturale da parte di diversi ceppi di topi (cioè C57BL/6) allo sviluppo della perdita ossea alveolare. Questo è anche problematico, in quanto questo ceppo è il più frequentemente utilizzato nella ricerca animale a base di murini35.

Le procedure esistenti descritte da Marchesan et al. e Abe e Hajishengallis sono state ideate per semplificare l’atto tecnico di collocare la legatura33,36. Purtroppo, il primo protocollo richiede attrezzature specializzate stampate in 3D e possiede il potenziale per la perdita prematura delle legature, aumentando così l’uso degli animali e i costi associati al tempo aggiuntivo trascorso in sala operatoria. Inoltre, entrambi i protocolli generano solo piccole regioni del parodonto malato disponibili per uno studio.

I vantaggi che si trovano con questa tecnica sono radicati nello studio simultaneo della disbiosi orale e dell’immunologia che governano il parodonto, l’utilizzo di animali a basso costo con diversi background genetici e semplici pratiche abitative e allevamento. Come tale, gli obiettivi dovrebbero essere di massimizzare i volumi di tessuto malato e, nel tentativo di praticare i principi di riduzione della ricerca animale, ridurre il consumo di animali a un livello il più basso possibile. Ciò richiede che tutti gli animali siano in grado di essere inclusi nelle analisi sperimentali37. Tuttavia, va notato che non importa quale modello animale della malattia parodontale viene utilizzato, non esiste un singolo modello che comprenda ogni elemento della fisiopatologia della PD.

Questo nuovo protocollo impiega il posizionamento di una legatura intorno a più denti molari mascellare utilizzando strumentazione e materiali che si trovano all’interno della maggior parte dei laboratori. Permette una quantità sufficiente di tempo per installare facilmente e con sicurezza una legatura che è improbabile che si amvulsi prematuramente. Infine, poiché le PMN coordinano la distruzione del parodonto nella PD, viene presentata anche una nuova metodologia per recuperare i neutrofili orali in modo analogo agli esseri umani.

Protocol

Tutti gli studi murine rispettavano i pertinenti regolamenti etici e sono stati approvati dall’Università di Toronto Animal Care Committee e dal Research Ethics Board (Protocollo 20011930). 1. Installazione della legatura NOTA: Questa è una procedura chirurgica non sterile che può essere eseguita in una sala operatoria standard. L’uso di animali privi di germi (non qui trattato) impone la manipolazione all’interno di un armadio di biosicurezza, l’uso di strumenti s…

Representative Results

Vengono forniti dati relativi alla citometria di flusso rappresentativo proveniente da campioni di risciacquo orale di un’ingenua (Figura 3A) e infiammata (Figura 3B) di cavità orale che si trovano secondaria mente alla parodontite indotta dalla legatura. Viene inoltre illustrato il ripristino di PMN da una legatura installata (Figura 3C). Le tensioni del canale del citometro di fl…

Discussion

L’elemento più critico associato all’uso del modello di parodontite indotta dalla legatura murina è centrato intorno alla ritenzione della legatura fino al momento del sacrificio o della rimozione intenzionale. La legatura biofilm-retentiva installata è in grado di indurre una significativa perdita di altezza ossea alveolare in appena 6 giorni, plateauing tra il periodo di 11-16 giorni39. La decisione di sacrificare i soggetti animali prima del periodo massimo di perdita ossea, rendendo questo …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

J. W. C. è supportato dal Canadian Institutes of Health Research (CIHR). Gli autori desiderano ringraziare la dott.ssa Chunxiang Sun per la sua assistenza nell’esecuzione della colorazione blu trypan.

Materials

Anti-mouse F4/80 Antibody BioLegend 123131 BV421, Clone BM8
Anti-mouse Ly6G Antibody BD 560602 PerCP-Cy5.5, Clone 1A8
C57BL/6 Male Mice Charles River 8 to 12 weeks old
Conical Centrifuge Tube FroggaBio TB15-500 15 mL
Conical Centrifuge Tube FroggaBio TB50-500 50 mL
FACS Buffer Multiple 1% BSA (BioShop), 2mM EDTA (Merck), 1x HBSS-/- (Gibco)
FACSDiva BD v8.0.1
Fibre-Lite Dolan-Jenner Model 180
FlowJo Tree Star v10.0.8r1
Heat Therapy Pump Hallowell HTP-1500
Hot Glass Bead Sterilizer Electron Microscopy Sciences 66118-10 Germinator 500
Iris Scissors Almedic 7602-A8-684 Straight
Ketamine Vetoquinol 100mg/mL
LSRFortessa BD X-20
Mouse Serum Sigma M5905-5ML
Nylon Mesh Filter Fisher Scientific 22-363-547 40 µm
Paraformaldehyde Fisher Scientific 28908 16% (w/v), Methanol Free
Phosphate-buffered Saline Sigma D1408-500ML Without CaCl2 and MgCl2, 10x
Plastic Disposable Syringes BD 309659 1 mL
Rat Serum Sigma R9759-5ML
Silk Suture Covidien SS652 C13 USP 5-0
Splinter Forceps Almedic 7726-A10-700 #1
Splinter Forceps Almedic 7727-A10-704 #5
Stereo Dissecting Microscope Carl Zeiss 28865 Photo-Zusatz
Sterile Hypodemic Needle BD 305111 26G X 1/2"
Syringe BD 309659 1 mL
Xylazine Rompun 20mg/mL

References

  1. Hajishengallis, G. Immunomicrobial pathogenesis of periodontitis: keystones, pathobionts, and host response. Trends in Immunology. 35 (1), 3-11 (2014).
  2. Pihlstrom, B. L., Michalowicz, B. S., Johnson, N. W. Periodontal diseases. Lancet. 366 (9499), 1809-1820 (2005).
  3. Richards, D. Oral Diseases affect some 3.9 Billion people. Evidence-Based Dentistry. 14 (2), 35 (2013).
  4. Listl, S., Galloway, J., Mossey, P. A., Marcenes, W. Global Economic Impact of Dental Diseases. Journal of Dental Research. 94 (10), 1355-1361 (2015).
  5. Hajishengallis, G. Periodontitis: from microbial immune subversion to systemic inflammation. Nature Reviews Immunology. 15 (1), 30-44 (2015).
  6. Preshaw, P. M., et al. Periodontitis and diabetes: a two-way relationship. Diabetologia. 55 (1), 21-31 (2012).
  7. Kampits, C., et al. Periodontal disease and inflammatory blood cytokines in patients with stable coronary artery disease. Journal of Applied Oral Sciences. 24 (4), 352-358 (2016).
  8. Fitzpatrick, S. G., Katz, J. The association between periodontal disease and cancer: A review of the literature. Journal of Dentistry. 38 (2), 83-95 (2010).
  9. Socransky, S. S., Haffajee, A. D. Periodontal microbial ecology. Periodontology 2000. 38 (1), 135-187 (2005).
  10. Marsh, P. D. Microbial Ecology of Dental Plaque and its Significance in Health and Disease. Advances in Dental Research. 8 (2), 263-271 (1994).
  11. Berezow, A. B., Darveau, R. P. Microbial shift and periodontitis. Periodontology 2000. 55 (1), 36-47 (2011).
  12. Roberts, F. A., Darveau, R. P. Microbial protection and virulence in periodontal tissue as a function of polymicrobial communities: symbiosis and dysbiosis. Periodontology 2000. 69 (1), 18-27 (2015).
  13. Macpherson, A. J., Harris, N. L. Interactions between commensal intestinal bacteria and the immune system. Nature Reviews Immunology. 4 (6), 478-485 (2004).
  14. Hajishengallis, G., et al. Low-Abundance Biofilm Species Orchestrates Inflammatory Periodontal Disease through the Commensal Microbiota and Complement. Cell Host Microbe. 10 (5), 497-506 (2011).
  15. Löe, H., Anerud, A., Boysen, H., Morrison, E. Natural history of periodontal disease in man. Rapid, moderate and no loss of attachment in Sri Lankan laborers 14 to 46 years of age. Journal of Clinical Periodontology. 13 (5), 431-445 (1986).
  16. Lakschevitz, F. S., et al. Identification of neutrophil surface marker changes in health and inflammation using high-throughput screening flow cytometry. Experimental Cell Research. 342 (2), 200-209 (2016).
  17. Fine, N., et al. Distinct Oral Neutrophil Subsets Define Health and Periodontal Disease States. Journal of Dental Research. 95 (8), 931-938 (2016).
  18. Landzberg, M., Doering, H., Aboodi, G. M., Tenenbaum, H. C., Glogauer, M. Quantifying oral inflammatory load: oral neutrophil counts in periodontal health and disease. Journal of Periodontal Research. 50 (3), 330-336 (2015).
  19. Bender, J. S., Thang, H., Glogauer, M. Novel rinse assay for the quantification of oral neutrophils and the monitoring of chronic periodontal disease. Journal of Periodontal Research. 41 (3), 214-220 (2006).
  20. Johnstone, A. M., Koh, A., Goldberg, M. B., Glogauer, M. A Hyperactive Neutrophil Phenotype in Patients With Refractory Periodontitis. Journal of Periodontology. 78 (9), 1788-1794 (2007).
  21. Figueredo, C. M. S., Fischer, R. G., Gustafsson, A. Aberrant Neutrophil Reactions in Periodontitis. Journal of Periodontology. 76 (6), 951-955 (2005).
  22. Christan, C., Dietrich, T., Hägewald, S., Kage, A., Bernimoulin, J. -. P. White blood cell count in generalized aggressive periodontitis after non-surgical therapy. Journal of Clinical Periodontology. 29 (3), 201-206 (2002).
  23. Oz, H. S., Puleo, D. A. Animal models for periodontal disease. Journal of Biomedicine and Biotechnology. , 1-8 (2011).
  24. Struillou, X., Boutigny, H., Soueidan, A., Layrolle, P. Experimental animal models in periodontology: a review. Open Dentistry Journal. 4 (1), 37-47 (2010).
  25. Baker, P. J., Evans, R. T., Roopenian, D. C. Oral infection with Porphyromonas gingivalis and induced alveolar bone loss in immunocompetent and severe combined immunodeficient mice. Archives of Oral Biology. 39 (12), 1035-1040 (1994).
  26. Oz, H. S., Ebersole, J. L. A novel murine model for chronic inflammatory alveolar bone loss. Journal of Periodontal Research. 45 (1), 94-99 (2010).
  27. Zubery, Y., et al. Bone resorption caused by three periodontal pathogens in vivo in mice is mediated in part by prostaglandin. Infections and Immunity. 66 (9), 4158-4162 (1998).
  28. Feuille, F., Ebersole, J. L., Kesavalu, L., Stepfen, M. J., Holt, S. C. Mixed infection with Porphyromonas gingivalis and Fusobacterium nucleatum in a murine lesion model: potential synergistic effects on virulence. Infections and Immunity. 64 (6), 2094-2100 (1996).
  29. Yoshimura, M., et al. Proteome analysis of Porphyromonas gingivalis cells placed in a subcutaneous chamber of mice. Oral Microbiology and Immunology. 23 (5), 413-418 (2008).
  30. Kesavalu, L., Ebersole, J. L., Machen, R. L., Holt, S. C. Porphyromonas gingivalis virulence in mice: induction of immunity to bacterial components. Infections and Immunity. 60 (4), 1455-1464 (1992).
  31. Liu, P., Haake, S. K., Gallo, R. L., Huang, C. A novel vaccine targeting Fusobacterium nucleatum against abscesses and halitosis. Vaccine. 27 (10), 1589-1595 (2009).
  32. Jiao, Y., et al. Induction of Bone Loss by Pathobiont-Mediated Nod1 Signaling in the Oral Cavity. Cell Host Microbe. 13 (5), 595-601 (2013).
  33. Abe, T., Hajishengallis, G. Optimization of the ligature-induced periodontitis model in mice. Journal of Immunological Methods. 394 (1-2), 49-54 (2013).
  34. de Molon, R. S., et al. Long-term evaluation of oral gavage with periodontopathogens or ligature induction of experimental periodontal disease in mice. Clinical Oral Investigations. 20 (6), 1203-1216 (2016).
  35. Baker, P. J., Dixon, M., Roopenian, D. C. Genetic control of susceptibility to Porphyromonas gingivalis-induced alveolar bone loss in mice. Infections and Immunity. 68 (10), 5864-5868 (2000).
  36. Marchesan, J., et al. An experimental murine model to study periodontitis. Nature Protocols. 13 (10), 2247-2267 (2018).
  37. Flecknell, P. Replacement, reduction and refinement. ALTEX: Alternatives to Animal Experiments. 19 (2), 73-78 (2002).
  38. Fine, N., et al. Primed PMNs in healthy mouse and human circulation are first responders during acute inflammation. Blood Advances. 3 (10), 1622-1637 (2019).
  39. Viniegra, A., et al. Resolving Macrophages Counter Osteolysis by Anabolic Actions on Bone Cells. Journal of Dental Research. 97 (10), 1160-1169 (2018).
  40. Häärä, O., et al. Ectodysplasin regulates activator-inhibitor balance in murine tooth development through Fgf20 signaling. Development. 139 (17), 3189-3199 (2012).
  41. Tsukasaki, M., et al. Host defense against oral microbiota by bone-damaging T cells. Nature Communications. 9 (1), 1-11 (2018).
  42. Hiyari, S., et al. Ligature-induced peri-implantitis and periodontitis in mice. Journal of Clinical Periodontology. 45 (1), 89-99 (2018).
  43. Eskan, M. A., et al. The leukocyte integrin antagonist Del-1 inhibits IL-17-mediated inflammatory bone loss. Nature Immunology. 13 (5), 465-473 (2012).
  44. Dutzan, N., et al. A dysbiotic microbiome triggers T H 17 cells to mediate oral mucosal immunopathology in mice and humans. Science Translational Medicine. 10 (463), 1-12 (2018).
  45. Chun, J., Kim, K. Y., Lee, J., Choi, Y. The analysis of oral microbial communities of wild-type and toll-like receptor 2-deficient mice using a 454 GS FLX Titanium pyrosequencer. BMC Microbiology. 10 (1), 1-8 (2010).
  46. Rovin, S., Costich, E. R., Gordon, H. A. The influence of bacteria and irritation in the initiation of periodontal disease in germfree and conventional rats. Journal of Periodontal Research. 1 (3), 193-204 (1966).
  47. Martín, R., Bermúdez-Humarán, L. G., Langella, P. Gnotobiotic Rodents: An In Vivo Model for the Study of Microbe-Microbe Interactions. Frontiers in Microbiology. 7, 1-7 (2016).
  48. Dutzan, N., et al. On-going Mechanical Damage from Mastication Drives Homeostatic Th17 Cell Responses at the Oral Barrier. Immunity. 46 (1), 133-147 (2017).
  49. Sima, C., et al. Nuclear Factor Erythroid 2-Related Factor 2 Down-Regulation in Oral Neutrophils Is Associated with Periodontal Oxidative Damage and Severe Chronic Periodontitis. The American Journal of Pathology. 186 (6), 1417-1426 (2016).

Play Video

Cite This Article
Chadwick, J. W., Glogauer, M. Robust Ligature-Induced Model of Murine Periodontitis for the Evaluation of Oral Neutrophils. J. Vis. Exp. (155), e59667, doi:10.3791/59667 (2020).

View Video