מדים להטות שיטת של טסיות האדם וקולטני פני שטח התא דרך קונוס-וזיקוק הלוח
Summary
אנו מתארים שיטה בפתרון כדי להחיל להטות אחיד כדי קולטני משטח טסיות באמצעות קונוס-צלחת ויסבנסה. ניתן להשתמש בשיטה זו גם באופן כללי יותר כדי להחיל הטיה על סוגי תאים אחרים ושברי תאים, ואין צורך לייעד זוג מסוים של ליגולי-קולטן.
Abstract
תאים ביולוגיים רבים לחוש את התכונות המכאניות של הסביבה המקומית שלהם באמצעות מכנינים, חלבונים שיכולים להגיב לכוחות כמו לחץ או רטבאליות מכני. מכניקנים מזהים את הגירויים שלהם ומעבירים אותות באמצעות מגוון גדול של מנגנונים. חלק מן התפקידים השכיחים ביותר עבור מכניטורים הם בתגובות נוירואליות, כמו מגע וכאב, או תאי שיער הפועלים בשיווי משקל ושמיעה. המכונה גם חשובה עבור סוגי תאים אשר נחשפים באופן קבוע למתח הטיה כגון תאים אנדותל, אשר קו כלי דם, או תאי דם אשר חווים את ההטיה במחזור הרגיל. ויסברוטרס הם מכשירים המזהים את צמיגות הנוזלים. בנוסף, ניתן להשתמש בגומדי הסיבוב להחלת כוח הטיה ידוע על נוזלים. היכולת של מכשירים אלה כדי להחדיר הטיה אחיד לנוזלים נוצל ללמוד נוזלים ביולוגיים רבים, כולל דם פלזמה. בנוסף, ניתן להשתמש ב-ויסבנסה להחלת הטיה על התאים בפתרון, ולבדיקת השפעות ההטיה בזוגות מסוימים של ליגטיים ולקולטן. כאן, אנו מנצלים חרוט-צלחת ומנסה לבחון את ההשפעות של רמות אנדודוגני של לחץ הטיה על טסיות שטופלו עם נוגדנים נגד טסיות הדם מכונאי קולטן המכונה GPIb-IX.
Introduction
מכניטורים הם חלבונים המגיבים לגירויים מכניים, כגון לחץ או עיוות מכני/דפורמציה. עבור חלק מהמכבשים, חישת הרטבאליות המכני הללו מפורשת לתפקוד סוגי התאים בהם הם מבוטאים. לקחת, למשל, קולטני למתוח ב baroreceptor נוירונים; אלה תעלות יון מכניתיים רגישות להסדיר לחץ דם על ידי חישת כלי דם “מתיחה”1,2. באוזן הפנימית, ערוצי יון על תאי השיער לזהות דפורמציות מכניות הנגרמת על ידי גלי קול3, ו מכני הסף נמוך המכונה מכונות (ltmrs) להקל על העברת מידע מישוש4. במקרים אחרים מספקים מכניקנים מידע חשוב לתא להקמת הדבקה או התפתחות. תאים יכולים לחוש קשיחות של הסביבה המקומית שלהם, והוא יכול להסתמך על כוחות הקונאקטאליה דרך שלד ציטוטין ואינטגרציה להכתיב צמיחה או התפשטות5,6.
כאשר לומדים קולטן-ליגונים ואינטראקציות בתא או רקמות מבוססי מודלים, שכיחות משותף קיים אשר יכול במהירות ובדייקנות לדווח את ההשפעות של שינוי טמפרטורה, pH, ליג, ריכוז, טונגניות, פוטנציאל הממברנה, ופרמטרים רבים אחרים שיכול להשתנות בvivo. עם זאת, אלה מספר שאומר עלול ליפול קצר כשמדובר לזהות את התרומה של כוח מכני כדי הפעלת הקולטן. אם התאים מחישה את הסביבה המיקרוקומבית שלהם, מזהה גלי קול או מגיבים למתיחה, דבר אחד שמשותף למכונה הזאת הוא שהם משתתפים באינטראקציות שבהן הליקטור, הקולטן או שניהם, מעוגנים ל שטח. Assays שפותחה כדי לבדוק את ההשפעות של כוחות מכניים על אינטראקציות הקולטן לעתים קרובות משקפים פרדיגמה זו. מיקרופלואידיקה ותאי הזרימה משמשים לחקר ההשפעות של הטיית זרימה על תאים וקולטנים7,8. סוגים אלה של ניסויים יש את היתרון של המאפשר כוונון עדין של שיעורי הטיה באמצעות מהירויות זרימה הוקמה. טכניקות אחרות להעסיק בדיקה מולקולרית פלורסנט כדי לזהות כוחות החלים על ידי תאים על משטחים ligand-עשיר, מניב בדיקה מדויקת של סדר הגודל והכיוונים של כוחות המעורבים באינטראקציה9,10.
בנוסף לתחושה המכונה היכן אחד או שניהם מעוגנים על פני השטח, הטיה לחץ עשוי להשפיע על חלבונים ותאים בתמיסה. זה נצפה לעתים קרובות בתאי הדם/חלבונים אשר כל הזמן במחזור, ועשוי להתבטא באמצעות הפעלה של מכונות מכונות כי הם בדרך כלל מעוגן משטח11, או באמצעות חשיפה של רצפי היעד אשר יהיה לחסימה תחת תנאים סטטיים12. עם זאת, טכניקות מעטות יחסית מאפשרות את ההשפעות של כוח ההטיה על חלקיקים בתמיסה. כמה גישות ב-פתרון להציג את ההטיה באמצעות תאים vortexing בהשעיה נוזל עם מהירויות שונות ומשכים, למרות גישות אלה לא יאפשר קביעה מדויקת מאוד של לחץ ההטיה שנוצר. מדידת צמיגות ברוטציה מדידה על ידי החלת כוח מסוים בהטיה לנוזלים. כאן אנו מתארים שיטה מיושמת לקביעת ההשפעה של שיעורי הטיה ספציפיים בתאים או שברי תאים בתמיסה.
אחד החלבונים המבוזרים ביותר על משטח הטסיות הוא מתחם גליקופרוטאין (GP) ליברות-IX. GPIb-IX הוא הקולטן העיקרי עבור חלבון הפלזמה פון Willebrand פקטור (VWF). יחד, זה קולטן-ליגניים וזוג כבר מוכר כבסיס של תגובת טסיות כדי להטות את הלחץ13. במקרה של נזק כלי דם, VWF נקשר קולגן חשוף במטריקס sub-אנדותל14, ובכך לגייס טסיות לאתר של פציעה באמצעות אינטראקציה Vwf-GPIb-IX. VWF מחויבות לאתר הכריכה שלה ביחידת המשנה GPIbα אם GPIb-IX תחת הלחץ הפיזיולוגי הטיה גורם התגלגלות של התחום המכונה המאובחושי הממברנה (MSD) אשר בתורו מפעיל GPIb-IX15. במחקר שנערך לאחרונה, הראינו כי נוגדנים נגד GPIbα, כמו אלה שנוצרו תרומבוציטופניה חיסונית רבים (ITP) חולים, הם גם מסוגלים לגרימת איתות טסיות באמצעות MSD התגלגלות תחת לחץ הטיה11. עם זאת, בניגוד VWF, אשר מקלה על גזירה המושרה GPIb-IX הפעלה על ידי ששתק את הקומפלקס תחת מחזור רגיל, הנוגדנים הדו בעלי היכולת להצליב טסיות באמצעות GPIb-IX ולהתפתח MSD במחזור הדם. בדרך זו, מתקן המופעל בדרך כלל על ידי הטיית פני השטח תחת הטיה ניתן להפעיל בתמיסה. בדוח הנוכחי, ניתן להדגים כיצד מבוסס על מדים מבוססי ומוח להטות את שיטת העבודה היה ממונפת כדי לזהות את ההשפעות של רמות ספציפיות של מתח הטיה על הפעלת הקולטן בפתרון.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המתואר בכתב יד זה מאפשר הערכה מהירה ומגוונת של ההשפעה של הטיית למינאר על טסיות דם וקולטני משטח התא. תוצאות הנציג הספציפיות המוצגות כאן מדגישים כיצד ההשפעות של מולטימאריק או ביונטי ליגנדס יכולות להיות מושפעות מזרימת הטיה. בנוסף ליישום זה, שיטת גזירה אחידה כוללת יישומים רחבים בהת…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
העבודה הרלוונטית למחקר זה נתמכת בחלקו על ידי המכון הלאומי לבריאות, ריאות ומכון הדם מענקים HL082808, HL123984 (ר), F31HL134241 (M.E.Q.). מימון שסופק גם על ידי NIH המכון הלאומי של מדעי הרפואה הכללית גרנט T32GM008367 (M.E.Q.); והטייס מענק כספים משירותי הבריאות של הילדים של אטלנטה ואוניברסיטת אמורי הזרמת ילדים ליבה. המחברים רוצים להודות ד ר הנס מורן על שיתוף הנוגדן 6B4, ואת הילדים אמורי המרכז לחקר הילד זרימת Cy, ליבת ליבה לתמיכה טכנית.
Materials
| APC anti-human CD62P (P-Selectin) | BioLegend | 304910 | |
| Brookfield Cap 2000+ Viscometer | Brookfield | – | |
| FITC-conjugated Erythrina cristagalli lectin (ECL) | Vector Labs | FL-1141 | |
| Pooled Normal Human Plasma | Precision Biologic | CCN-10 | |
| Vacutainer Light Blue Blood Collection Tube (Sodium Citrate) | BD | 369714 | |
| Vacutainer Blood Collection Set, 21G x ¾" Needle | BD | 367287 |
References
- Sullivan, M. J., et al. Non-voltage-gated Ca2+ influx through mechanosensitive ion channels in aortic baroreceptor neurons. Circulation Research. 80 (6), 861-867 (1997).
- Lansman, J. B., Hallam, T. J., Rink, T. J. Single stretch-activated ion channels in vascular endothelial cells as mechanotransducers. Nature. 325 (6107), 811-813 (1987).
- Fettiplace, R. Hair Cell Transduction, Tuning, and Synaptic Transmission in the Mammalian Cochlea. Comprehensive Physiology. 7 (4), 1197-1227 (2017).
- Zimmerman, A., Bai, L., Ginty, D. D. The gentle touch receptors of mammalian skin. Science. 346 (6212), 950-954 (2014).
- Nelson, C. M., et al. Emergent patterns of growth controlled by multicellular form and mechanics. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102 (33), 11594-11599 (2005).
- Yu, C. H., Law, J. B., Suryana, M., Low, H. Y., Sheetz, M. P. Early integrin binding to Arg-Gly-Asp peptide activates actin polymerization and contractile movement that stimulates outward translocation. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (51), 20585-20590 (2011).
- Wen, L., et al. A shear-dependent NO-cGMP-cGKI cascade in platelets acts as an auto-regulatory brake of thrombosis. Nature Communications. 9 (1), 4301 (2018).
- Marki, A., Gutierrez, E., Mikulski, Z., Groisman, A., Ley, K. Microfluidics-based side view flow chamber reveals tether-to-sling transition in rolling neutrophils. Scientific Reports. 6, 28870 (2016).
- Brockman, J. M., et al. Mapping the 3D orientation of piconewton integrin traction forces. Nature Methods. 15 (2), 115-118 (2018).
- Wang, X., et al. Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors. Scientific Reports. 6, 21584 (2016).
- Quach, M. E., et al. Fc-independent immune thrombocytopenia via mechanomolecular signaling in platelets. Blood. 131 (7), 787-796 (2018).
- Cao, W., Krishnaswamy, S., Camire, R. M., Lenting, P. J., Zheng, X. L. Factor VIII accelerates proteolytic cleavage of von Willebrand factor by ADAMTS13. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 105 (21), 7416-7421 (2008).
- Kroll, M. H., Hellums, J. D., McIntire, L. V., Schafer, A. I., Moake, J. L. Platelets and shear stress. Blood. 88 (5), 1525-1541 (1996).
- Pareti, F. I., Niiya, K., McPherson, J. M., Ruggeri, Z. M. Isolation and characterization of two domains of human von Willebrand factor that interact with fibrillar collagen types I and III. Journal of Biological Chemistry. 262 (28), 13835-13841 (1987).
- Deng, W., et al. Platelet clearance via shear-induced unfolding of a membrane mechanoreceptor. Nature Communications. 7, 12863 (2016).
- Ikeda, Y., et al. The role of von Willebrand factor and fibrinogen in platelet aggregation under varying shear stress. Journal of Clinical Investigation. 87 (4), 1234-1240 (1991).
- Westerhof, N., Stergiopulos, N., Noble, M. I. . Snapshots of hemodynamics: an aid for clinical research and graduate education. , (2010).
- Liang, X., et al. Specific inhibition of ectodomain shedding of glycoprotein Ibalpha by targeting its juxtamembrane shedding cleavage site. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (12), 2155-2162 (2013).
- Samsel, L., et al. Imaging flow cytometry for morphologic and phenotypic characterization of rare circulating endothelial cells. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 84 (6), 379-389 (2013).
- Basiji, D. A., Ortyn, W. E., Liang, L., Venkatachalam, V., Morrissey, P. Cellular image analysis and imaging by flow cytometry. Clinics in Laboratory Medicine. 27 (3), 653-670 (2007).
- Quach, M. E., Chen, W., Li, R. Mechanisms of platelet clearance and translation to improve platelet storage. Blood. 131 (14), 1512-1521 (2018).
