用螺旋粘度计对人血小板和细胞表面受体进行均匀剪切检测
Summary
我们描述了一种用邻面色谱法将均匀剪切应用于血小板表面受体的溶液法。这种方法也可以更广泛地应用剪切其他细胞类型和细胞片段, 不需要针对特定的配体受体对。
Abstract
许多生物细胞组织通过机械感受器感知其局部环境的机械特性, 这些蛋白质可以对压力或机械扰动等力作出反应。机械感受器通过多种机制检测其刺激并传输信号。机械受体的一些最常见的角色是神经元的反应, 如触摸和疼痛, 或在平衡和听觉中发挥作用的毛细胞。对于经常暴露在剪切应力下的细胞类型, 如内皮细胞、血管线或在正常循环中经历剪切的血细胞, 机械培养也很重要。粘度计是检测流体粘度的设备。旋转粘度计也可用于对流体施加已知的剪切力。这些仪器在流体中引入均匀剪切的能力已被用来研究许多生物流体, 包括血液和血浆。粘度计也可用于将剪切作用于溶液中的细胞, 并测试剪切对特定配体受体对的影响。在这里, 我们利用面板粘度计测试内源性剪切应力水平对血小板的内源性水平的影响, 抗体对血小板机械感觉受体复合物 Gplib-ix 进行治疗。
Introduction
机械感受器是对机械刺激有反应的蛋白质, 如压力或机械摄动/变形。对于一些机械感受器来说, 感知这些机械扰动与它们表达的细胞类型的函数是明确的。以压力感受器神经元中的拉伸受体为例;这些机械敏感离子通道通过感知血管 “拉伸”1,2来调节血压。在内耳, 毛细胞上的离子通道检测声波3引起的机械变形,皮肤低阈值机械感受器 (ltmr) 有助于触觉信息的传递4。在其他情况下, 机械感受器为细胞建立粘附或生长提供了重要信息。细胞可以感觉到其局部环境的刚性, 并可能依靠收缩力通过肌动蛋白细胞骨架和整合素来决定生长或传播5,6。
在研究细胞或组织模型中的受体配体相互作用时, 存在着常见的检测方法, 可以快速、准确地报告温度、ph 值、配体浓度、色调、膜电位和许多其他参数的变化效果它在体内可能会有所不同。然而, 当涉及到检测机械力对受体激活的贡献时, 这些相同的检测方法可能会失败。无论细胞是感知它们的微环境、检测声波还是对拉伸的反应, 上述机械感受器的一个共同点是, 它们参与的相互作用是配体、受体或两者都锚定在表面。为测试机械力对受体相互作用的影响而开发的检测往往反映了这一范式。微流控和流室用于研究剪切流对细胞和受体的影响 7,8。这些类型的实验的优点是允许通过既定的流速微调剪切速率。其他技术使用荧光分子探针来检测细胞在富含配体表面施加的力, 从而准确地读出相互作用 9,10所涉及的力的大小和方向.
除了一个或两个伙伴锚定在表面的情况下发生的机械被组织外, 剪切应力还可能影响溶液中的蛋白质和细胞。这通常是在血液细胞/蛋白质中观察到的, 这些蛋白质在循环中不断存在, 并可能通过激活通常是表面锚定的11 的机械感受器或通过暴露将被阻断的目标序列而表现出来。静态条件12。然而, 测定剪切力对溶液中颗粒的影响的技术相对较少。一些溶液中的方法引入了不同速度和持续时间的流体悬浮液中通过涡旋细胞的剪切, 尽管这些方法可能无法非常精确地确定产生的剪切应力。旋转粘度计通过对流体施加特定的剪切力来测量粘度。本文介绍了一种用于确定特定层流剪切速率对溶液中细胞或细胞碎片的影响的方法。
血小板表面表达最强烈的蛋白质之一是糖蛋白 (GP) Ib-IX 复合物。GPIb-IX 是血浆蛋白 von Willebrand 因子 (VWF) 的主要受体。总之, 这种受体配体对一直被认为是血小板对剪切应力13 反应的基础。在血管损伤的情况下, VWF 与内皮下基质14中暴露的胶原蛋白结合, 从而通过 Vwf-gubib-ix 相互作用将血小板吸收到损伤部位。如果 GPIb-IX 在生理剪切应力作用下引起膜近端机械感域 (MSD) 的展开, 而膜近端机械传感器域 (MSD) 又会激活 Gpiib-ix 15, 则 VWF 与 gpibα亚基中的结合位点接触。在最近的一项研究中, 我们已经表明, 针对 GPIbα的抗体, 就像许多免疫血小板减少症 (ITP) 患者产生的抗体一样, 也能够通过在剪切应力下展开的 msd 诱导血小板信号。然而, 与 VWF 不同的是, 这种抗物质通过在正常循环下固定复合物来促进剪切诱导的 GPIb-IX 激活, 它能够通过 GPIb-IX 交联血小板, 并在循环中展开 MSD。这样, 通常通过剪切作用下的表面固定激活的机械感受器就可以在溶液中激活。在本报告中, 我们将演示如何利用基于粘度的均匀剪切分析来检测特定水平的剪切应力对溶液中受体激活的影响。
Protocol
Representative Results
Discussion
本手稿中描述的协议允许快速和多才多艺的评估层剪切对血小板和细胞表面受体的影响。这里介绍的具体代表性结果强调了剪切流如何影响多价或二价配体的影响。除了这种应用外, 均匀的剪切分析在观察剪切依赖性效应方面也有广泛的应用。在没有已知的配体受体对的情况下, 均匀的剪切分析还可以检测剪切对细胞形状和信号等因素的影响, 尤其是与流式细胞仪分析配对时。图 5 b 部分提到<strong …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
与这项研究有关的工作得到了国家卫生研究院 (NIH) 国家心脏、肺和血液研究所的部分支持, 这些研究授予 HL082808、HL123984 (r. l.) 和 F31HL134241 (m. e. q.)。国家卫生研究院国家普通医学研究所也提供了 T32GM008367 (m. e. q.) 赠款;亚特兰大儿童保健和埃默里大学儿童流式细胞术核心的试点拨款。作者感谢 Hans Deckmyn 博士分享6B4 抗体, 并感谢埃默里·儿童儿童研究中心流式细胞术核心提供技术支持。
Materials
| APC anti-human CD62P (P-Selectin) | BioLegend | 304910 | |
| Brookfield Cap 2000+ Viscometer | Brookfield | – | |
| FITC-conjugated Erythrina cristagalli lectin (ECL) | Vector Labs | FL-1141 | |
| Pooled Normal Human Plasma | Precision Biologic | CCN-10 | |
| Vacutainer Light Blue Blood Collection Tube (Sodium Citrate) | BD | 369714 | |
| Vacutainer Blood Collection Set, 21G x ¾" Needle | BD | 367287 |
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