Единый сдвига Ассси для человека тромбоцитов и клеточных поверхностных рецепторов через конус-пластины Viscometry
Summary
Мы описываем в растворе метод нанесения равномерного сдвига на рецепторы поверхности тромбоцитов с помощью конусно-пластинной вискомерности. Этот метод также может быть использован более широко для нанесения сдвига на другие типы клеток и клеточных фрагментов и не нужно нацеливаться на конкретную пару лиганд-рецепторов.
Abstract
Многие биологические клетки/ ткани ощущают механические свойства своей местной среды с помощью механорецепторов, белков, которые могут реагировать на такие силы, как давление или механические возмущения. Механорецепторы обнаруживают свои стимулы и передают сигналы через большое разнообразие механизмов. Некоторые из наиболее распространенных ролей для механорецепторов в нейронных реакций, как прикосновение и боль, или волосковые клетки, которые функционируют в равновесии и слуха. Mechanosensation также имеет важное значение для типов клеток, которые регулярно подвергаются стресс сдвига, таких как эндотелиальные клетки, которые выстраивают кровеносные сосуды, или клетки крови, которые испытывают сдвига в нормальном кровообращении. Вискометры являются устройствами, которые обнаруживают вязкость жидкостей. Вращающиеся вязки также могут быть использованы для применения известной силы сдвига к жидкостям. Способность этих инструментов вводить однородный нож для жидкости была использована для изучения многих биологических жидкостей, включая кровь и плазму. Viscometry также может быть использован для применения сдвига к клеткам в растворе, и для проверки влияния сдвига на конкретные пары лиганд-рецепторов. Здесь мы используем конусно-пластинную вискометрию для проверки влияния эндогенного уровня стресса сдвига на тромбоциты, обработанные антителами против тромбоцитов механосенсорного рецептора комплекса GPIb-IX.
Introduction
Механорецепторы являются белки, которые реагируют на механические раздражители, такие как давление или механические возмущения / деформации. Для некоторых механорецепторов, зондирование этих механических возмущений явно функция типов клеток, в которых они выражаются. Возьмем, к примеру, растяжечные рецепторы в барорецепторных нейронах; эти механочувствительные ионные каналы регулируют кровяное давление, чувствуя сосудистые “растяжка”1,2. Во внутреннем ухе ионные каналы на волосяныхклетках обнаруживают механические деформации, вызванные звуковыми волнами 3, а кожные низкопороговые механорецепторы (LTMRs) облегчают передачу тактильной информации4. В других случаях механорецепторы предоставляют важную информацию клетке для установления сливов или роста. Клетки могут чувствовать жесткость их местной окружающей среды, и может полагаться на контрактные силы через актин цитоскелет и integrins диктовать рост или распространение5,6.
При изучении взаимодействия рецепторов-лигандов в клеточных или тканевых моделях существуют общие анализы, которые могут быстро и точно сообщать о последствиях изменения температуры, рН, концентрации лиганда, тонистики, мембранного потенциала и многих других параметров которые могут варьироваться в vivo. Тем не менее, эти же анализы могут не хватать, когда дело доходит до обнаружения вклада механической силы в активацию рецепторов. Ли клетки зондирования их микроокружения, обнаружения звуковых волн, или реагирования на стрейч, одна вещь, вышеупомянутые механорецепторы имеют в общем, что они участвуют в взаимодействиях, где лиганд, рецептор, или оба, закреплены на поверхности. Анализы, разработанные для проверки влияния механических сил на взаимодействия рецепторов, часто отражают эту парадигму. Микрофлюитика и камеры потока используются для изучения влияния сдвига потока на клетки и рецепторы7,8. Преимущество подобных экспериментов в том, что они позволяют точно настраивать скорость сдвига с помощью установленных скоростей потока. Другие методы используют флуоресцентные молекулярные зонды для обнаружения сил, применяемых клетками на богатых лигандой поверхностях, что дает точную считывание величины и ориентации сил, участвующих во взаимодействии9,10.
В дополнение к mechanosensation происходит, когда один или оба партнера закреплены на поверхности, сдвига стресс может повлиять на белки и клетки в растворе. Это часто наблюдается в клетках крови / белков, которые постоянно находятся в обращении, и может проявляться через активацию механорецепторов, которые, как правило, поверхностные якорь11, или через воздействие целевых последовательностей, которые будут окклюзии под статических условий12. Тем не менее, относительно меньше методов анализа влияния сдвига силы на частицы в растворе. Некоторые в решении подходов ввести сдвига через вихревые клетки в жидкости подвески с различной скоростью и продолжительностью, хотя эти подходы не могут позволить очень точное определение сдвига стресс генерируется. Вращающиеся вязкости измеряют вязкость, применяя определенную силу сдвига к жидкостям. Здесь мы описываем прикладной метод для определения влияния конкретных ставок ламинара сдвига на клетки или фрагменты клеток в растворе.
Одним из наиболее высоко выраженных белков на поверхности тромбоцитов является комплекс гликопротеинов (GP) Ib-IX. GPIb-IX является основным рецептором плазменного белка фон Виллебранд фактор (VWF). Вместе, эта рецептор-лиганд пара уже давно признана в качестве основы тромбоцитов ответ на сдвига стресс13. В случае повреждения сосудов, VWF связывается с открытым коллагеном в субэндотелиальной матрице14, таким образом, вербовка тромбоцитов к месту травмы через взаимодействие VWF-GPIb-IX. Участие VWF на своем связывающем месте в подразделении GPIb, если GPIb-IX при физиологическом стрессе сдвига индуцирует развертывание мембранно-проксимального механосенсорного домена (MSD), который, в свою очередь, активирует GPIb-IX15. В недавнем исследовании, мы показали, что антитела против GPIb, как и те, которые генерируются во многих иммунных тромбоцитопении (ITP) пациентов, также способны индуцировать тромбоцитов сигнализации через MSD разворачивается под сдвига стресс11. Однако, в отличие от VWF, который облегчает активацию GPIb-IX, индуцированной сдвигами, обездвиживая комплекс при нормальном обращении, двухвалентные антитела способны перекладывать тромбоциты через GPIb-IX и разворачивать MSD в обращении. Таким образом, механорецептор, который обычно активируется путем иммобилизации поверхности под сдвига может быть активирован в растворе. В настоящем докладе, мы продемонстрируем, как вискометр основе равномерного сдвига асссбыл использовать для обнаружения последствий конкретных уровней сдвига нагрузки на активацию рецепторов в растворе.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол, описанный в данной рукописи, позволяет быстро и универсально оценить влияние ламинарового сдвига на тромбоциты и рецепторы поверхности клеток. Конкретные представленные здесь репрезентативные результаты подчеркивают, как влияние многомерных или двухвалентных лиганд може?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа, относящееся к этому исследованию, была частично поддержана Национальными институтами здравоохранения (NIH) Национальным институтом сердца, легких и крови, гранты HL082808, HL123984 (R.L.) и F31HL134241 (M.E.). Финансирование также обеспечивается грантом Национального института общих медицинских наук НФН Т32Г008367 (М.Е.З.); и пилотные грантовые фонды от детского здравоохранения Атланты и Университета Эмори педиатрического потока Cytometry Core. Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Ганса Декммина за совместное использование антител 6B4 и Детского научно-исследовательского центра Emory Flow Cytometry Core за техническую поддержку.
Materials
| APC anti-human CD62P (P-Selectin) | BioLegend | 304910 | |
| Brookfield Cap 2000+ Viscometer | Brookfield | – | |
| FITC-conjugated Erythrina cristagalli lectin (ECL) | Vector Labs | FL-1141 | |
| Pooled Normal Human Plasma | Precision Biologic | CCN-10 | |
| Vacutainer Light Blue Blood Collection Tube (Sodium Citrate) | BD | 369714 | |
| Vacutainer Blood Collection Set, 21G x ¾" Needle | BD | 367287 |
References
- Sullivan, M. J., et al. Non-voltage-gated Ca2+ influx through mechanosensitive ion channels in aortic baroreceptor neurons. Circulation Research. 80 (6), 861-867 (1997).
- Lansman, J. B., Hallam, T. J., Rink, T. J. Single stretch-activated ion channels in vascular endothelial cells as mechanotransducers. Nature. 325 (6107), 811-813 (1987).
- Fettiplace, R. Hair Cell Transduction, Tuning, and Synaptic Transmission in the Mammalian Cochlea. Comprehensive Physiology. 7 (4), 1197-1227 (2017).
- Zimmerman, A., Bai, L., Ginty, D. D. The gentle touch receptors of mammalian skin. Science. 346 (6212), 950-954 (2014).
- Nelson, C. M., et al. Emergent patterns of growth controlled by multicellular form and mechanics. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102 (33), 11594-11599 (2005).
- Yu, C. H., Law, J. B., Suryana, M., Low, H. Y., Sheetz, M. P. Early integrin binding to Arg-Gly-Asp peptide activates actin polymerization and contractile movement that stimulates outward translocation. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (51), 20585-20590 (2011).
- Wen, L., et al. A shear-dependent NO-cGMP-cGKI cascade in platelets acts as an auto-regulatory brake of thrombosis. Nature Communications. 9 (1), 4301 (2018).
- Marki, A., Gutierrez, E., Mikulski, Z., Groisman, A., Ley, K. Microfluidics-based side view flow chamber reveals tether-to-sling transition in rolling neutrophils. Scientific Reports. 6, 28870 (2016).
- Brockman, J. M., et al. Mapping the 3D orientation of piconewton integrin traction forces. Nature Methods. 15 (2), 115-118 (2018).
- Wang, X., et al. Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors. Scientific Reports. 6, 21584 (2016).
- Quach, M. E., et al. Fc-independent immune thrombocytopenia via mechanomolecular signaling in platelets. Blood. 131 (7), 787-796 (2018).
- Cao, W., Krishnaswamy, S., Camire, R. M., Lenting, P. J., Zheng, X. L. Factor VIII accelerates proteolytic cleavage of von Willebrand factor by ADAMTS13. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 105 (21), 7416-7421 (2008).
- Kroll, M. H., Hellums, J. D., McIntire, L. V., Schafer, A. I., Moake, J. L. Platelets and shear stress. Blood. 88 (5), 1525-1541 (1996).
- Pareti, F. I., Niiya, K., McPherson, J. M., Ruggeri, Z. M. Isolation and characterization of two domains of human von Willebrand factor that interact with fibrillar collagen types I and III. Journal of Biological Chemistry. 262 (28), 13835-13841 (1987).
- Deng, W., et al. Platelet clearance via shear-induced unfolding of a membrane mechanoreceptor. Nature Communications. 7, 12863 (2016).
- Ikeda, Y., et al. The role of von Willebrand factor and fibrinogen in platelet aggregation under varying shear stress. Journal of Clinical Investigation. 87 (4), 1234-1240 (1991).
- Westerhof, N., Stergiopulos, N., Noble, M. I. . Snapshots of hemodynamics: an aid for clinical research and graduate education. , (2010).
- Liang, X., et al. Specific inhibition of ectodomain shedding of glycoprotein Ibalpha by targeting its juxtamembrane shedding cleavage site. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (12), 2155-2162 (2013).
- Samsel, L., et al. Imaging flow cytometry for morphologic and phenotypic characterization of rare circulating endothelial cells. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 84 (6), 379-389 (2013).
- Basiji, D. A., Ortyn, W. E., Liang, L., Venkatachalam, V., Morrissey, P. Cellular image analysis and imaging by flow cytometry. Clinics in Laboratory Medicine. 27 (3), 653-670 (2007).
- Quach, M. E., Chen, W., Li, R. Mechanisms of platelet clearance and translation to improve platelet storage. Blood. 131 (14), 1512-1521 (2018).
