Un ensayo de cizalla uniforme para los receptores humanos de plaquetas y de superficie celular a través de Viscometry de placa cónica
Summary
Describimos un método en solución para aplicar una cizalla uniforme a los receptores de superficie plaquetaria usando viscometry de placa cónica. Este método también se puede utilizar más ampliamente para aplicar cizallamiento a otros tipos de células y fragmentos de células y no necesita apuntar a un par de ligando-receptor específico.
Abstract
Muchas células/tejidos biológicos detectan las propiedades mecánicas de sus ambientes locales a través de mecánicos, proteínas que pueden responder a fuerzas como la presión o perturbaciones mecánicas. Los mecánicos detectan sus estímulos y transmiten señales a través de una gran diversidad de mecanismos. Algunas de las funciones más comunes para los mecánicos son las respuestas neuronales, como el tacto y el dolor, o las células ciliadas que funcionan en el equilibrio y la audición. La mechanosensation también es importante para los tipos celulares que se exponen regularmente a la tensión de cizallamiento como las células endoteliales, que la línea de los vasos sanguíneos, o células sanguíneas que experimentan cizalla en la circulación normal. Los viscometers son dispositivos que detectan la viscosidad de los fluidos. Los viscosítros rotatorios también se pueden utilizar para aplicar una fuerza de cizallamiento conocida a los fluidos. La capacidad de estos instrumentos para introducir una cizalla uniforme en los fluidos ha sido explotada para estudiar muchos fluidos biológicos, incluyendo sangre y plasma. Viscometry también se puede utilizar para aplicar cizallamiento a las células en una solución, y para probar los efectos de la cizalla en pares de ligando-receptores específicos. Aquí, utilizamos viscometría de placa cónica para probar los efectos de los niveles endógenos de estrés por cizallamiento en las plaquetas tratadas con anticuerpos contra el complejo de receptores mecanosensoriales plaquetarios GPIB-IX.
Introduction
Los mecánicos son proteínas que responden a estímulos mecánicos, como la presión o la perturbación/deformación mecánica. Para algunos mecánicos, la detección de estas perturbaciones mecánicas es explícita a la función de los tipos de células en las que se expresan. Tomar, por ejemplo, los receptores de estiramiento en las neuronas barorreceptora; estos canales de iones mecanosensibles regulan la presión arterial por detección vascular “estiramiento”1,2. En el oído interno, los canales de iones en las células ciliadas detectan las deformaciones mecánicas causadas por las ondas sonoras3, y los mecánicos de bajo umbral cutáneo (ltmrs) facilitan la transmisión de la información táctil4. En otros casos, los mecánicos proporcionan información importante a la célula para el establecimiento de la adherencia o el crecimiento. Las células pueden percibir la rigidez de su entorno local, y pueden depender de fuerzas contráctiles a través del citoesqueleto de actina e integrinas para dictar crecimiento o propagación de5,6.
Cuando se estudian interacciones receptor-ligando en modelos basados en células o tejidos, existen ensayos comunes que pueden reportar de forma rápida y precisa los efectos de alterar la temperatura, el pH, la concentración de ligando, la tonicidad, el potencial de la membrana y muchos otros parámetros que pueden variar en vivo. Sin embargo, estos mismos ensayos pueden caer corto cuando se trata de detectar la contribución de la fuerza mecánica a la activación del receptor. Ya sea que las células detectan su microambiente, detecten ondas sonoras o respondan al estiramiento, una cosa que los mecánicos antes mencionados tienen en común es que están participando en interacciones donde el ligando, receptor, o ambos, están anclados a un Superficie. Los ensayos desarrollados para probar los efectos de las fuerzas mecánicas en las interacciones del receptor a menudo reflejan este paradigma. Las cámaras de flujo y microfluidos se utilizan para estudiar los efectos del flujo de cizallamiento en las células y los receptores7,8. Estos tipos de experimentos tienen la ventaja de permitir el ajuste fino de las tasas de cizallamiento a través de velocidades de flujo establecidas. Otras técnicas emplean sondas moleculares fluorescentes para detectar las fuerzas aplicadas por las células en superficies ricas en ligando, produciendo una lectura precisa de la magnitud y las orientaciones de las fuerzas involucradas en la interacción9,10.
Además de la mecanosensación que ocurre cuando uno o ambos socios están anclados a una superficie, el estrés cortante puede afectar las proteínas y las células en solución. Esto se observa a menudo en las células sanguíneas/proteínas que están constantemente en la circulación, y puede manifestarse a través de la activación de los mecánicos que normalmente están anclados en la superficie11, o a través de la exposición de las secuencias de destino que sería ocludido bajo condiciones estáticas12. Sin embargo, relativamente menos técnicas de ensayo de los efectos de la fuerza de cizallamiento en partículas en solución. Algunos enfoques en la solución introducen la cizalla a través de las células de vórtex en la suspensión de fluidos con diferentes velocidades y duraciones, aunque estos enfoques pueden no permitir una determinación muy precisa de la tensión de cizallamiento generada. Los viscosítros rotatorios miden la viscosidad aplicando una fuerza de cizallamiento específica a los fluidos. Aquí describimos un método aplicado para determinar el efecto de las tasas de cizallamiento laminar específicas en las células o fragmentos celulares en solución.
Una de las proteínas más altamente expresadas en la superficie de las plaquetas es el complejo IB-IX de glicoproteína (GP). GPIb-IX es el receptor primario de la proteína plasmática von Willebrand factor (FWF). Juntos, este par receptor-ligand ha sido reconocido durante mucho tiempo como la base de la respuesta plaquetaria a la tensión de cizallamiento13. En caso de daño vascular, el VWF se une al colágeno expuesto en la matriz sub-endotelial14, reclutando así las plaquetas en el sitio de la lesión a través de la interacción vWF-GPIB-IX. La participación del VWF en su sitio de Unión en la subunidad GPIbα si el GPIb-IX bajo tensión fisiológica de cizallamiento induce el despliegue de un dominio mecanosensorial de membrana proximal (MSD) que a su vez activa el GPIb-IX15. En un estudio reciente, hemos demostrado que los anticuerpos contra el GPIbα, como los generados en muchos pacientes con trombocitopenia inmunitaria (PTI), también son capaces de inducir la señalización plaquetaria vía MSD desplegando bajo tensión de cizallamiento11. Sin embargo, a diferencia del VWF, que facilita la activación inducida por cizalla GPIb-IX ininmovilizando el complejo bajo circulación normal, los anticuerpos bivalentes son capaces de unir las plaquetas a través de GPIb-IX y desplegar el MSD en circulación. De esta manera, un mecánico que normalmente se activa por inmovilización superficial bajo cizalla se puede activar en solución. En el presente informe, demostraremos cómo se aprovechó un ensayo de cizallamiento uniforme basado en viscómetro para detectar los efectos de niveles específicos de tensión de cizallamiento en la activación del receptor en la solución.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo descrito en este manuscrito permite una evaluación rápida y versátil del efecto de la cizalla laminar sobre los receptores de las plaquetas y de la superficie celular. Los resultados representativos específicos presentados aquí subrayan cómo los efectos de los ligandos multiméricos o bivalentes pueden verse afectados por el flujo de cizallamiento. Además de esta aplicación, un ensayo de cizallamiento uniforme tiene amplias aplicaciones en la observación de efectos que dependen de la cizalla. En aus…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El trabajo pertinente a este estudio fue apoyado en parte por los institutos nacionales de salud (NIH) del Instituto Nacional del corazón, los pulmones y la sangre otorga HL082808, HL123984 (R.L.), y F31HL134241 (M.E.Q.). Los fondos también proporcionados por el Instituto Nacional de ciencias médicas generales de NIH otorgan T32GM008367 (M.E.Q.); y fondos de becas piloto de children’s Healthcare of Atlanta y la citometría de flujo pediátrica de la Universidad Emory Core. A los autores les gustaría agradecer al Dr. Hans Deckmyn por compartir el anticuerpo 6B4, y el centro de investigación pediátrica de la citometría de flujo de Emory children’s para soporte técnico.
Materials
| APC anti-human CD62P (P-Selectin) | BioLegend | 304910 | |
| Brookfield Cap 2000+ Viscometer | Brookfield | – | |
| FITC-conjugated Erythrina cristagalli lectin (ECL) | Vector Labs | FL-1141 | |
| Pooled Normal Human Plasma | Precision Biologic | CCN-10 | |
| Vacutainer Light Blue Blood Collection Tube (Sodium Citrate) | BD | 369714 | |
| Vacutainer Blood Collection Set, 21G x ¾" Needle | BD | 367287 |
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