成体マウスの解離と再生:哺乳類のブラステマ形成と腸内形成を調べるための簡単なモデル
Summary
ここでは、哺乳類のブラセマ形成と内皮形成を調べ、蛍光免疫組織化学と順次生体内マイクロコンピュータ断層撮影により分析した成体マウス末端ファランクス切断のプロトコルを提示する。
Abstract
ここでは、成体マウス遠位末端ファランクス(P3)切断のプロトコルを提示し、皮炎形成とイントラメブラヌス系化を含むエピモーフィック再生の手続き的に単純で再現可能な哺乳類モデルを提示する。蛍光免疫組織化学および順次生体内マイクロコンピュータ断層撮影(μCT)。哺乳類の再生は、末端ファランクス(P3)の遠位領域を伝える切断に限定される。より近位レベルで切断された数字は、再生に失敗し、線維性治癒および瘢痕形成を受ける。再生応答は、増殖性芽細胞の形成によって媒介され、続いて骨の骨再生を経て、切断された骨格の長さを回復させる。P3切断は、哺乳類のエピモーフィック再生を調査する前臨床モデルであり、線維性治癒を正常な再生応答に置き換える治療戦略の設計のための強力なツールである。我々のプロトコルは、蛍光免疫組織化学を使用して1)早期および後期のブラセマ細胞集団を同定し、2)再生の文脈における再血管化の研究、および3)複雑な骨を必要とせずに内膜骨化を調査する安定化デバイス。また、生体内μCTでシーケンシャルを用いて、切断後の形態変化を調べる高解像度画像を作成し、再生過程で同じ数字の体積と長さの変化を定量化することも実証しています。このプロトコルは、哺乳類におけるエピモーフィック応答と組織再生応答の両方を調査する上で大きな有用性を提供していると考えています。
Introduction
ヒトおよびマウスを含む哺乳動物は、末端ファランクス(P3)1、2、3の遠位切断後に自分の桁の先端を再生する能力を有する。マウスでは、再生応答は切断レベルに依存します。ますます近位桁切断は、P3爪マトリックス4、5、6に近接および近接切断で完全な再生障害が完全になるまで、徐々に減衰した再生応答を示す,7,8.P3再生は、ブラステマの形成によって媒介され、切断された構造9を再生するために形態形成を受ける増殖細胞の集団として定義される。切断によって失われた構造を再生するブラステマの形成は、エピモーフィック再生と呼ぶプロセスで、傷害後の従来の組織修復から多組織レベルのP3再生応答を区別する6、 10.P3再生は、創傷治癒11、12、骨の有面性を含む複雑な再生プロセスを調査するための再現性と手続き的に単純なモデルです 11,12,血管化13、末梢神経再生14、および骨へのブラステマル変換は、内膜神経化15を介して行う。
免疫組織化学を用いたこれまでの研究では、ブラステマが不均一、血管、低酸素、および高増殖性11、13、15、16であることが実証されている。遠位P3切断に続いて、初期の芽細胞は、最初にP3骨膜および内皮に関連し、骨表面15に隣接する堅牢な増殖および新生骨形成によって特徴付けされる。骨の劣化と創傷の閉鎖に続いて、異種芽細胞は、骨膜細胞とエンドストール関連細胞の結合によって形成され、続いて骨を含むブラステマル成分の分化が起こる。15.
傷害に対する骨修復は、典型的には、内軟骨骨化によって、すなわち、その後の骨形成17、18のためのテンプレートを形成する初期軟骨カルスを介して起こる。長い骨内皮形成、すなわち、軟骨中間体を持たない骨形成は、一般的に複雑な気晴らし装置または外科的固定を用いて誘導される19、20である。数字の再生応答は、従来のトラメランブラス系化モデルに対する利点を提供する前臨床モデルである:1)内皮骨化を刺激するために外部または内部固定後損傷を必要としない、2)それは各動物から4桁の数字を用いて行い、動物の使用を最小限に抑えながらサンプルを最大化し、3)生体内マイクロコンピュータ断層撮影(μCT)解析を容易かつ迅速に行うことができる。
本研究では、再生可能で堅牢な再生応答を達成するために標準化されたP3切断面を示す。さらに、我々は、視芽細胞の形成、再生のコンテキストでの再血管化、および皮骨内形成による骨へのブラステマル変換を可視化するためにパラフィンセクションを使用して最適化された蛍光免疫組織化学プロトコルを実証する。骨化。また、順次生体内μCTを用いて、再生過程における骨形態、体積、長さの変化を同じ桁で同定する方法も示す。このプロトコルの目的は、切断後の哺乳類の芽細胞形成を調査し、イントラメブラヌス骨再生の研究のために、生体内μCTにおける蛍光免疫組織化学および順次2つの技術を実証することである。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、成体マウス遠位P3切断の標準化された手順、蛍光免疫組織化学染色を視覚化し、ブラステマ形成および内膜神経化を調査し、シーケンシャルインビボμCTスキャンを記述する。切断後の骨形態、体積、および長さの変化を識別する。P3切断は、ブラセマ形成を引き起こす再生創傷環境を分析するユニークで手続き的にシンプルで再現可能なモデルです。さらに、P3の数字モデ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
宗岡研究室とテキサスゲノム医学研究所(TIGM)のメンバーに感謝します。この研究はテキサスA&M大学の支援を受けました。
Materials
| Protein Block Serum Free | DAKO | X0909 | Ready to use |
| Mouse anti-PCNA antibody | Abcam | ab29 | 1:2000 dilution |
| Rat anti-CXCR4 antibody | R&D Systems | MAB21651 | 1:500 dilution |
| Rabbit anti-human vWF XIII antibody | DAKO | A0082 | 1:800 dilution |
| Rabbit anti-osterix, SP7 antibody | Abcam | ab22552 | 1:400 dilution |
| Rabbit anti-Runx2 antibody | Sigma-Aldrich Co. | HPA022040 | 1:250 dilution |
| Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A21235 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11008 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Invitrogen | A11077 | 1:500 dilution |
| Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 | Ready to use |
| Surgipath Decalicifier 1 | Leica Biosystems | 3800400 | Ready to use |
| Z-Fix, Aqueous buffered zinc formalin fixative | Anatech LTD | 174 | Ready to use |
| CD-1 Female Mouse | Envigo | ICR(CD-1) | 8-12-weeks-old |
| vivaCT 40 | SCANCO Medical |
References
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