Mitochondria और Endoplasmic Reticulum इमेजिंग द्वारा सहसंबंधी प्रकाश और मात्रा इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी
Summary
हम सहसंबंधी प्रकाश और मात्रा इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर के आनुवंशिक संशोधन के बाद पूरी कोशिकाओं में mitochondria और एंडोप्लाज्मिक रेटिक्युलम के वितरण का अध्ययन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जिसमें एसकोरबेट पेरोक्सिडस 2 और हॉर्सराडिश पेरोक्सिडस धुंधला शामिल है, के साथ और एक ही खंड में लक्ष्य जीन के बिना कोशिकाओं के सीरियल अनुभाग, और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के माध्यम से सीरियल इमेजिंग.
Abstract
कोशिकीय आर्गेनेल्स, जैसे माइटोकोंड्रिया और एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर), विभिन्न प्रकार के कार्यों को करने के लिए एक नेटवर्क बनाते हैं। इन अत्यधिक घुमावदार संरचनाओं सेलुलर शर्तों के आधार पर एक गतिशील नेटवर्क बनाने के लिए विभिन्न आकारों में जोड़ रहे हैं। Mitochondria और ईआर के बीच इस नेटवर्क के दृश्य सुपर संकल्प फ्लोरोसेंट इमेजिंग और प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने का प्रयास किया गया है; हालांकि, सीमित संकल्प विस्तार में mitochondria और ईआर के बीच झिल्ली का निरीक्षण करने के लिए अपर्याप्त है. संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी सेलुलर organelles के अवलोकन के लिए अच्छा झिल्ली विपरीत और नैनोमीटर पैमाने पर संकल्प प्रदान करता है; हालांकि, यह असाधारण समय लेने वाली है जब अत्यधिक घुमावदार organelles के तीन आयामी (3 डी) संरचना का आकलन. इसलिए, हमने सहसंबंधी प्रकाश-इलेक्ट्रोन माइक्रोस्कोपी (CLEM) और वॉल्यूम इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी तकनीकों के माध्यम से माइटोकोंड्रिया और ईआर की आकृति विज्ञान को देखा जिसमें वर्धित एसकोरबेट पेरोक्सिडस 2 और हॉर्सराडिश पेरोक्सिडस धुंधला होता है। एक एन ब्लॉक धुंधला विधि, अल्ट्राथिन सीरियल सेक्शनिंग (आरे टोमोग्राफी), और मात्रा इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 3 डी संरचना का निरीक्षण करने के लिए लागू किए गए थे। इस प्रोटोकॉल में, हम mitochondria और ईआर की विस्तृत संरचनात्मक अध्ययन करने के लिए CLEM और 3 डी इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का एक संयोजन का सुझाव देते हैं।
Introduction
माइटोकोंड्रिया और एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) झिल्ली से बंधे सेलुलर आर्गेनेल्स हैं। उनके कनेक्शन उनके कार्य के लिए आवश्यक है, और उनके नेटवर्क से संबंधित प्रोटीन1वर्णित किया गया है. माइटोकोंड्रिया और ईआर के बीच की दूरी लगभग 100 एनएम प्रकाश माइक्रोस्कोपी2का उपयोग करते हुए सूचित की गई है; तथापि, हाल ही में सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी3 और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम)4 अध्ययनों से पता चला है कि यह लगभग 10-25 एनएम पर काफी छोटा है। सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी में प्राप्त संकल्प EM की तुलना में कम है, और विशिष्ट लेबलिंग आवश्यक है. EM mitochondria और ईआर के बीच कनेक्शन के संरचनात्मक अध्ययन के लिए एक पर्याप्त उच्च संकल्प विपरीत प्राप्त करने के लिए एक उपयुक्त तकनीक है. हालांकि, एक नुकसान सीमित z-अक्ष जानकारी है क्योंकि पतली वर्गों लगभग 60 एनएम या पारंपरिक संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (TEM) के लिए पतली होना चाहिए. पर्याप्त EM z-अक्ष इमेजिंग के लिए, त्रि-आयामी इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (3DEM) 5 इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, यह पूरी कोशिकाओं के पतले धारावाहिक वर्गों के सैकड़ों की तैयारी शामिल है, जो बहुत मुश्किल काम है कि केवल कुछ कुशल प्रौद्योगिकीविदों में महारत हासिल है. इन पतली वर्गों नाजुक formvar फिल्म लेपित एक छेद TEM ग्रिड पर एकत्र कर रहे हैं. यदि फिल्म एक गिड्डी पर टूट तीज, सीरियल इमेजिंग और वॉल्यूम पुनर्निर्माण संभव नहीं है। सीरियल ब्लॉक-फेस स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SBEM) 3DEM के लिए एक लोकप्रिय तकनीक है कि या तो एक हीरे की चाकू (Dik-SBEM) या एक केंद्रित आयन बीम (FIB-SEM) के साथ स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (SEM) वैक्यूम कक्ष के अंदर विनाशकारी एन ब्लॉक अनुभाग का उपयोग करता है 6. हालांकि, क्योंकि उन तकनीकों सभी सुविधाओं पर उपलब्ध नहीं हैं, हम सरणी टोमोग्राफी7 सीरियल सेक्शनिंग और SEM का उपयोग कर सुझाव देते हैं। सरणी टोमोग्राफी में, अल्ट्रामाइक्रोटोम का उपयोग करके काटे गए सीरियल सेक्शनों को टीईएम ग्रिड के बजाय कांच के कवरस्लिप में स्थानांतरित किया जाता है और प्रकाश माइक्रोस्कोपी तथा SEM8के माध्यम से कल्पना की जाती है। बैकस्कैटर इलेक्ट्रॉन (बीएसई) इमेजिंग के लिए संकेत को बढ़ाने के लिए, हमने ऑस्मोरियमटेट्रॉक्साइड (ओसो 4) को ओस्मोफिलिक थायोकार्बोहाइड्राज़ाइड (टीएचच)9के साथ एक एन ब्लॉक ईएम धुंधला प्रोटोकॉल का उपयोग किया, जिससे हमें बिना चित्र प्राप्त करने में सक्षम बनाता है पोस्ट-एम्बेडिंग डबल धुंधला.
इसके अतिरिक्त, mitochondrial मार्कर SCO1 (साइटोक्रोम c oxidase विधानसभा प्रोटीन 1)- ascorbate peroxidase 2 (APEX2)10 आणविक टैग EM स्तर पर mitochondria कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. एपेक्स2 लगभग 28 केडीए है और सोयाबीन एस्कोरबेट पेरोक्सिडस11से प्राप्त होता है। यह उसी तरह है कि हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैग प्रोटीन प्रकाश माइक्रोस्कोपी में प्रयोग किया जाता है EM स्तर पर विशिष्ट प्रोटीन की विस्तृत स्थान दिखाने के लिए विकसित किया गया था. APEX2 कोकारक हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच2ओ 2) की उपस्थिति में टैग की साइट पर एक अघुलनशील osmiophilicबहुलक में 3,3′ -diaminobenzidine (DAB) धर्मान्तरित. APEX2 EM में पारंपरिक एंटीबॉडी लेबलिंग के लिए एक विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, पूरे सेल की गहराई में एक प्रोटीन स्थानीयकरण के साथ. दूसरे शब्दों में, APEX2-टैग प्रोटीन अल्ट्रा-cryosectioning के बाद इम्यूनोगोल्ड लेबलिंग और permebilization के बिना विशिष्ट osmication11 द्वारा कल्पना की जा सकती है। हॉर्सराडिश peroxidase (HRP) भी एक संवेदनशील टैग है कि एक स्थानीयकृत वेग में DAB के एच2ओ2निर्भर बहुलकीकरण उत्प्रेरित करता है, OsO4के साथ उपचार के बाद EM इसके विपरीत प्रदान करते हैं. ईआर लक्ष्य पेप्टाइड अनुक्रम HRP-KDEL (lys-asp-glu-leu)12 एक पूरे सेल के भीतर ईआर कल्पना करने के लिए लागू किया गया था। आनुवंशिक टैग का उपयोग करने के हमारे प्रोटोकॉल का मूल्यांकन करने के लिए और कम osmium और TCH (आरटीओ विधि) के साथ धुंधला दाग, एक ही समय में osmication प्रभाव का उपयोग कर, हम के साथ और आरटीओ में प्रत्येक आनुवंशिक टैग के उपयोग के बिना झिल्ली इसके विपरीत तुलना में ब्लॉक धुंधला. हालांकि 3DEM सरणी टोमोग्राफी और DAB के साथ APEX और HRP के साथ धुंधला है, क्रमशः, अन्य प्रयोजनों के लिए उपयोग किया गया है, हमारे प्रोटोकॉल अद्वितीय है क्योंकि हम 3DEM और DAB mitochondria और ईआर लेबलिंग के लिए धुंधला के लिए सरणी टोमोग्राफी संयुक्त है. विशेष रूप से, हम के साथ और एक ही खंड में APEX टैग जीन के बिना पांच कोशिकाओं को दिखाया, जो कोशिकाओं पर आनुवंशिक संशोधन के प्रभाव की जांच में सहायता की.
Protocol
Representative Results
Discussion
EM का उपयोग कर एक नैनोमीटर संकल्प पर विशिष्ट प्रोटीन के सेलुलर स्थानीयकरण का निर्धारण प्रोटीन के सेलुलर कार्यों को समझने के लिए महत्वपूर्ण है. आम तौर पर, वहाँ दो तकनीकों EM के माध्यम से एक लक्ष्य प्रोटीन ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अनुसंधान कोरिया मस्तिष्क अनुसंधान विज्ञान और आईसीटी (19-BR-01-08) द्वारा वित्त पोषित संस्थान के माध्यम से KBRI बुनियादी अनुसंधान कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था, और कोरिया के राष्ट्रीय अनुसंधान फाउंडेशन (एनआरएफ) कोरिया सरकार (MSIT) द्वारा वित्त पोषित अनुदान (नहीं. 2019R1A2C1010634. SCO1-APEX2 और HRP-KDEL plasmids कृपया ह्यून-वू री (सियोल राष्ट्रीय विश्वविद्यालय) द्वारा प्रदान की गई. टीईएम डेटा KBRI में मस्तिष्क अनुसंधान कोर सुविधाओं में अधिग्रहण किया गया.
Materials
| Glutaraldehyde | EMS | 16200 | Use only in fume hood |
| Paraformaldehyde | EMS | 19210 | Use only in fume hood |
| Sodium cacodylate | EMS | 12300 | |
| Osmium tetroxide 4 % aqueous solution | EMS | 16320 | Use only in fume hood |
| Epon 812 | EMS | 14120 | EMbed 812- 20 ml/ DDSA- 16 ml/ NMA- 8 ml/ DMP-30 – 0.8 ml |
| Ultra-microtome Leica ARTOS 3D | Leica | ARTOS 3D | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400 | Hazardous chemical |
| Lead citrate | EMS | 17900 | |
| 35mm Gridded coverslip dish | Mattek | P35G-1.5-14-CGRD | |
| Glow discharger | Pelco | easiGlow | |
| Formvar carbon coated Copper Grid | Ted Pella | 01805-F | |
| Hydrochloric acid | SIGMA | 258148 | |
| Fugene HD | Promega | E2311 | |
| Glycine | SIGMA | G8898 | |
| 3,3′ -diaminobenzamidine (DAB) | SIGMA | D8001 | Hazardous chemical |
| 30% Hydrogen peroxide solution | Merck | 107210 | |
| Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | SIGMA | P3289 | |
| 0.22 um syringe filter | Sartorius | 16534 | |
| Thiocarbonyldihydrazide | SIGMA | 223220 | Use only in fume hood |
| Potassium hydroxide | Fluka | 10193426 | |
| L-aspartic acid | SIGMA | A9256 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Transmission electron microscopy | FEI | Tecnai G2 | |
| Indium tin oxide (ITO) coated glass coverslips | SPI | 06489-AB | fragil glass |
| Isopropanol | Fisher Bioreagents | BP2618-1 | |
| Diamond knife | Leica | AT-4 | |
| Inveted light microscopy | Nikon | ECLipse TS100 | |
| Scanning electron microscopy | Zeiss | Auriga |
References
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