Method Article

미토콘드리아 및 코피포지티컬 라이트 및 부피 전자 현미경에 의한 산후성 망상 이미징

DOI:

10.3791/59750

⸱

July 20th, 2019

 , 
1Neural Circuits Research Group, Korea Brain Research Institute

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 아스코르바테 과산화수역 2 및 고추냉이 과산화증 염색을 포함하는 상관경 및 부피 전자 현미경을 사용하여 유전자 변형 후 전체 세포에서 미토콘드리아 및 호반 망상염식의 분포를 연구하는 프로토콜을 제시하고, 동일한 섹션에 있는 표적 유전자의 유무에 관계없이 세포의 직렬 단면도, 및 전자 현미경 검사법을 통해 직렬 화상 진찰.

Abstract

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미토콘드리아 및 기관망망(ER)과 같은 세포 소기관은 다양한 기능을 수행하는 네트워크를 만듭니다. 이러한 고곡선 구조는 셀룰러 조건에 따라 동적 네트워크를 형성하기 위해 다양한 모양으로 접혀 있습니다. 미토콘드리아와 ER 사이 이 네트워크의 가시화는 초고해상도 형광 화상 진찰 및 광 현미경 검사법을 사용하여 시도되었습니다; 그러나, 제한된 해결책은 미토콘드리아와 ER 사이 막을 상세히 관찰하기에 불충분하다. 전송 전자 현미경 검사법은 세포 소기관의 관찰을 위한 좋은 막 대조 및 나노미터 규모 해결책을 제공합니다; 그러나 고곡선 소기관의 3차원(3D) 구조를 평가할 때 는 매우 시간이 많이 걸립니다. 따라서, 우리는 강화된 아스코르브베이트 과산화공2 및 고추냉이 과옥시다아제 염색을 사용하여 상관경연산빛전자현미경법(CLEM) 및 부피 전자현미경기술을 통해 미토콘드리아와 ER의 형태를 관찰하였다. 3D 구조를 관찰하기 위해 엔블록 염색 방법, 초박형 직렬 단면화(배열 단층 촬영) 및 부피 전자 현미경을 적용하였다. 이 프로토콜에서는, 우리는 미토콘드리아와 ER의 상세한 구조적인 연구를 능력을 발휘하기 위하여 CLEM와 3D 전자 현미경 검사법의 조합을 건의합니다.

Introduction

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미토콘드리아및기관망망소(ER)는 막결합 세포소기관입니다. 그들의 연결은 그들의 기능에 필요하고, 그들의 네트워크와관련있는 단백질은 1을 기술되었습니다. 미토콘드리아와 ER 사이의 거리는 가벼운 현미경 검사법을 사용하여 약 100 nm로 보고되었습니다2; 그러나, 최근 초고해상도 현미경 검사법3 및 전자 현미경 검사법 (EM)4 연구 결과는 대략 10-25 nm에서 상당히 더 작은 것으로 나타났습니다. 초고해상도 현미경 검사법에서 달성된 분해능은 EM보다 낮으며 특정 라벨링이 필요합니다. EM은 미토콘드리아와 ER 사이의 연결에 대한 구조적 연구를 위해 충분히 고분해능 대비를 달성하기에 적합한 기술이다. 그러나, 종래의 투과 전자현미경(TEM)의 경우 얇은 단면이 약 60 nm 또는 더 얇아야 하기 때문에 제한된 z축 정보가 제한된 단점이다. 충분한 EM z 축 화상 진찰을 위해, 3차원 전자 현미경검사법 (3DEM)는 5를 사용할 수 있습니다. 그러나, 이것은 단지 몇몇 숙련된 기술자가 마스터한 아주 까다로운 일인 전체 세포의 얇은 직렬 단면도의 수백의 준비를 관련시킵니다. 이러한....

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Protocol

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1. SCO1-APEX2 및 HRP-KDEL 플라스미드 벡터를 가진 패턴격자 배양 접시 및 세포 형질혈을 가진 세포 배양

  1. 종자 1 x 105 HEK293T 세포는 Dulbecco의 수정 된 독수리 배지 (DMEM)에서 37 °C에서 5 % CO2를 포함하는 가습 된 분위기에서 35mm 유리 그리드 바닥 배양 접시에 배치하여 10 % 태아 소 혈청, 100 U / mL로 보충했습니다. 페니실린, 및 100 U / mL 연쇄상 구균.
  2. 세포를 파종 한 다음 날, 50 %-60 % 컨플루앙으로 성장했을 때 제조업체의 지침에 따라 형질 감염 시약을 사용하여 세포에 SCO1-APEX210 및 HRP-KDEL12 플라스미드를 도입하십시오 (SCO1-APEX2 cDNA 0.5 μg + HRP-KDEL 플라스미드 DNA 0.5 μg 당 3 μL 트랜스펙션 시약).

2. 패턴 배양 접시에 성장하는 세포의 가벼운 현미경 검사법 및 APEX2 및 HRP를 위한 DAB 염색

  1. 형질전환 후 16-24시간에서, 모든 배양 배지를 제거하고 즉시 250 μL의 따뜻한(30-37°C) 고정 액액을 첨가한다(표 1)에 부드러운 파이펫팅을....

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Results

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그림 1은 이 프로토콜의 일정및 워크플로를 설명합니다. 프로토콜은 7 일이 필요합니다. 그러나 SEM 이미징에 소요된 시간에 따라 증가할 수 있습니다. 세포 형질감염의 경우, 세포의 결합은 전체 그리드 플레이트의 바닥을 덮지 않도록 제어되어야 한다(도1A). 높은 세포 밀도는 빛 현미경 및 EM 관찰 도중 관심 있는 세포의 확인을 방지할 수 있었습니다. 우리는 배양 접시에 있는 수많은 배양세포 중에서 효율적으로 형질감염된 세포를 선택하기 위하여 APEX2 및 HRP를 표현한 유전으로 표를 붙인 플라스미드를 이용했습니다. 우리는 HEK293T 세포를 배양하고 공동 형질감염 세포에서 SCO1-연결된 APEX2(미토콘드리아 막 간 공간 [IMS]) 및 HRP 접합 KDEL(ER)의 발현을 확인하였다. 가벼운 현미경 검사법하에서, APEX2 형질감염된 세포는 갈색으로 염색된 반면, 형질감염이 없는 세포는 얼룩이 없는 채로 남아 있었다(그림1A 및.......

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Discussion

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EM을 사용하여 나노미터 해상도에서 특정 단백질의 세포 국소화를 결정하는 것은 단백질의 세포 기능을 이해하는 데 매우 중요합니다. 일반적으로 EM을 통해 표적 단백질의 국소화를 연구하는 두 가지 기술이 있다. 하나는 1960년부터 EM에서 사용되어 온 면역골 기술이며, 다른 하나는 최근에 개발된 유전자 부호타호16을사용하는 기술이다. 전통적인 면역금 기술은 표지된 단백질의 위치를 보여주기 위하여 항체 공액 금 입자 또는 양자점을 채택했습니다. 그러나, 고품질 항체에 대한 요구 사항 및 수지 및 고정제에 의해 영향을받는 항체의 침투 효율로 인해,이 기술은17크게 제한된다. 구체적으로, 면역골 라벨링은 주로 엔블록 금속 염색 및 강한 오스뮴 고정없이 초박형 섹션의 표면에 제한되기 때문에, 이 기술은 현대 3DEM18에직접 적용되지 않는다. SBEM 및 어레이 단층 촬영을 포함한 최근의 3DEM 방법을 단백.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 한국과학기술정보통신부(19-BR-01-08)의 지원을 받는 한국뇌연구원과 한국정부(MSIT)의 후원을 받은 한국뇌연구원(NRF)을 통해 지원되었다. 2019R1A2C10634). SCO1-APEX2와 HRP-KDEL 플라스미드는 이현우(서울대학교)가 친절하게 제공했다. TEM 데이터는 KBRI의 뇌 연구 핵심 시설에서 수집되었습니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
글루타르알데히드EMS16200흄 후드에서만 사용
파라포름알데히드EMS19210흄 후드에서만 사용
소듐 카코딜레이트EMS12300
오스뮴 테트록사이드 4% 수용액EMS16320흄 후드에서만 사용
Epon 812EMS14120EMbed 812- 20 ml/ DDSA- 16 ml/ NMA- 8 ml/ DMP-30 - 0.8 ml
초극소형 라이카 ARTOS 3D라이카ARTOS 3D
우라닐 아세테이트EMS22400유해 화학 물질
납 구연산EMS17900
35mm 그리드 커버 슬립 접시MattekP35G-1.5-14-CGRD
글로우 배출기PelcoeasiGlow
Formvar 탄소 코팅 구리 그리드Ted Pella01805-F
염산SIGMA258148
Fugene HDPromegaE2311
글리신SIGMAG8898
3,3′ -diaminobenzamidine (DAB)SIGMAD8001유해 화학물질
30% 과산화수소 용액Merck107210
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrateSIGMAP3289
0.22 um 주사기 필터Sartorius16534
ThiocarbonyldihydrazideSIGMA223220흄 후드에서만 사용
산화칼륨 Fluka10193426
L-아스파르트산SIGMAA9256
에탄올Merck100983
투과 전자 현미경FEITecnai G2
인듐 주석 산화물 (ITO) 코팅 유리 커버 슬립SPI06489-ABfragil 유리
이소프로판올Fisher BioreagentsBP2618-1
다이아몬드 나이프LeicaAT-4
Inveted 광 현미경NikonECLipse TS100
주사 전자 현미경ZeissAuriga
염 수

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Krols, M., et al. Mitochondria-associated membranes as hubs for neurodegeneration. Acta Neuropathologica. 131 (4), 505-523 (2016).
  2. Svendsen, E. J., Pedersen, R., Moen, A., Bjork, I. T.

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