Mitocondri e reticulum imaging endoplasmico di microscopia elettronica di luce correlata e volume

Summary

Presentiamo un protocollo per studiare la distribuzione di mitocondri e reticolo endoplasmico in intere cellule dopo la modificazione genetica utilizzando la microscopia elettronica di luce e volume correlata, tra cui l’ascorbate perossidasi 2 e la colorazione della perossidia di rafano, sezionamento seriale di cellule con e senza il gene bersaglio nella stessa sezione e imaging seriale tramite microscopia elettronica.

Abstract

Gli organelli cellulari, come i mitocondri e il reticolo endolasmico (ER), creano una rete per svolgere una varietà di funzioni. Queste strutture altamente curve sono piegate in varie forme per formare una rete dinamica a seconda delle condizioni cellulari. La visualizzazione di questa rete tra mitocondri ed ER è stata tentata utilizzando l’imaging a fluorescenza a super-risoluzione e la microscopia leggera; tuttavia, la risoluzione limitata non è sufficiente per osservare in dettaglio le membrane tra i mitocondri e il ER. La microscopia elettronica a trasmissione fornisce un buon contrasto della membrana e una risoluzione su scala nanometrica per l’osservazione degli organelli cellulari; tuttavia, è eccezionalmente dispendioso in termini di tempo quando si valuta la struttura tridimensionale (3D) di organelli altamente curvi. Pertanto, abbiamo osservato la morfologia dei mitocondri e del ER attraverso la microscopia correlativa degli elettroni di luce (CLEM) e le tecniche di microscopia elettronica del volume utilizzando una maggiore perossia ascorbate 2 e la colorazione della perossia di rafano. Un metodo di colorazione en bloc, la sezionamento seriale ultrasottile (tomografia a matrice) e la microscopia elettronica del volume sono stati applicati per osservare la struttura 3D. In questo protocollo, suggeriamo una combinazione di microscopia elettronica CLEM e 3D per eseguire studi strutturali dettagliati di mitocondri ed ER.

Introduction

I mitocondri e i reticoli endolasmici (ER) sono organelli cellulari legati alla membrana. La loro connessione è necessaria per la loro funzione, e le proteine legate alla loro rete sono state descritte¹. La distanza tra i mitocondri e il ER è stata riportata come circa 100 nm utilizzando la microscopia luminosa²; tuttavia, recenti studi di microscopia a super-risoluzione³ ed elettroscopia (EM)⁴ hanno rivelato che è notevolmente più piccolo, a circa 10-25 nm. La risoluzione raggiunta nella microscopia a super-risoluzione è inferiore a EM ed è necessaria un’etichettatura specifica. EM è una tecnica adatta per ottenere un contrasto sufficientemente ad alta risoluzione per gli studi strutturali delle connessioni tra mitocondri e ER. Tuttavia, uno svantaggio è rappresentato dalle informazioni limitate sull’asse z, in quanto le sezioni sottili devono essere di circa 60 nm o più sottili per la microscopia elettronica a trasmissione convenzionale (TEM). Per una sufficiente imaging dell’asse z EM, è possibile utilizzare la microscopia elettronica tridimensionale (3DEM)⁵. Tuttavia, questo comporta la preparazione di centinaia di sottili sezioni seriali di intere cellule, che è un lavoro molto difficile che solo pochi tecnologi qualificati hanno imparato. Queste sezioni sottili vengono raccolte su griglie TEM a foro rivestite con pellicola di forma fragile. Se il film si rompe su una cintura, l’imaging seriale e la ricostruzione del volume non sono possibili. La microscopia elettronica a scansione seriale a blocchi (SBEM) è una tecnica popolare per 3DEM che utilizza la sezionamento distruttivo del blocco all’interno della camera a vuoto del microscopio elettronico a scansione (SEM) con un coltello a diamante (Dik-SBEM) o un fascio ionico focalizzato (FIB-SEM) ⁶. Tuttavia, poiché tali tecniche non sono disponibili in tutte le strutture, suggeriamo la tomografia array⁷ utilizzando il sezionamento seriale e SEM. Nella tomografia a matrice, le sezioni seriali tagliate con un ultramicrotoma vengono trasferite su una vetrina di vetro invece di una griglia TEM e visualizzate tramite microscopia leggera e SEM⁸. Per migliorare il segnale per l’imaging di elettroni backscatter (BSE), abbiamo utilizzato un protocollo di colorazioneen bloc EM che impiega cellule fisse osmioum tetrossido (OsO 4) con thiocarbohydrazide (TCH)⁹osmiofilia doppia colorazione post-incorporamento.

Inoltre, il marcatore mitocondriale SCO1 (proteina di assemblaggio citocromatico c ossidasi 1)– ascorbate peroxidase 2 (APEX2)¹⁰ tag molecolare è stato utilizzato per visualizzare i mitocondri a livello di EM. APEX2 è di circa 28 kDa ed è derivato da soia ascorbate perossidasi¹¹. È stato sviluppato per mostrare la posizione dettagliata di proteine specifiche a livello EM nello stesso modo in cui la proteina con etichettatura proteica fluorescente verde viene utilizzata nella microscopia leggera. APEX2 converte 3,3′ -diaminobenzidina (DAB) in un polimero osmiofilo insolubile nel sito del tag in presenza del cofattore di perossido di idrogeno (H₂O₂). APEX2 può essere utilizzato come alternativa all’etichettatura tradizionale degli anticorpi in EM, con una localizzazione delle proteine per tutta la profondità dell’intera cellula. In altre parole, la proteina con etichetta APEX2 può essere visualizzata mediante osmicazione specifica¹¹ senza etichettatura immunogold e permeabilizzazione dopo l’ultracriosezione. La perossidasi di rafano (HRP) è anche un tag sensibile che catalizza la polimerizzazione dipendente da DAB H₂O₂in un precipitato localizzato, fornendo contrasto EM dopo il trattamento con OsO₄. La sequenza di peptidi bersaglio ER HRP-KDEL (lys-asp-glu-leu)¹² è stata applicata per visualizzare ER all’interno di un’intera cellula. Per valutare il nostro protocollo di utilizzo di tag genetici e di attenuazione in blocco con osmio ridotto e TCH (metodo rOTO), utilizzando l’effetto osmicazione allo stesso tempo, abbiamo confrontato il contrasto della membrana con e senza l’uso di ogni tag genetico in rOTO en bloc colorazione. Anche se 3DEM con tomografia array e colorazione DAB con APEX e HRP sono stati, rispettivamente, utilizzati per altri scopi, il nostro protocollo è unico perché abbiamo combinato la tomografia di array per la colorazione 3DEM e DAB per la colorazione dei mitocondri e del ER. In particolare, abbiamo mostrato cinque cellule con e senza geni etichettati con APEX nella stessa sezione, il che ha aiutato a studiare l’effetto della modificazione genetica sulle cellule.

Protocol

1. Coltura cellulare con piatto di coltura della griglia modellato e trasfezione cellulare con SCO1-APEX2 e vettore plasmid HRP-KDEL Seme 1 x 105 cellule HEK293T mettendole in piatti di coltura con fondo griglia in vetro da 35 mm in un’atmosfera umidificata contenente il 5% di CO2 a 37 gradi centigradi nel mezzo di Dulbecco modificato Eagle (DMEM) integrato con 10% siero bovino fetale, 100 U/mL penicillina e 100 U/mL streptomycin. Il giorno dopo la semina delle cellule, quando so…

Representative Results

Nella Figura 1 vengono descritti la pianificazione e il flusso di lavoro per questo protocollo. Il protocollo richiede 7 giorni; tuttavia, a seconda del tempo dedicato all’imaging SEM, questo può aumentare. Per la trafezione cellulare, la confluenza delle cellule deve essere controllata in modo da non coprire la parte inferiore dell’intera piastra della griglia (Figura 1A). Un’alta densità cellulare potrebbe impedire l’identificazione della cellula di interesse durante il microscopio l…

Discussion

Determinare la localizzazione cellulare di proteine specifiche a risoluzione di nanometri utilizzando EM è fondamentale per comprendere le funzioni cellulari delle proteine. In generale, ci sono due tecniche per studiare la localizzazione di una proteina bersaglio tramite EM. Una è la tecnica dell’immunogolda, che è stata utilizzata in EM dal 1960, e l’altra è una tecnica che utilizza tag geneticamente codificati di recente¹⁶. Le tecniche tradizionali di immunogold hanno impiegato particelle d…

Materials

Glutaraldehyde	EMS	16200	Use only in fume hood
Paraformaldehyde	EMS	19210	Use only in fume hood
Sodium cacodylate	EMS	12300
Osmium tetroxide 4 % aqueous solution	EMS	16320	Use only in fume hood
Epon 812	EMS	14120	EMbed 812- 20 ml/ DDSA- 16 ml/ NMA- 8 ml/ DMP-30 – 0.8 ml
Ultra-microtome Leica ARTOS 3D	Leica	ARTOS 3D
Uranyl acetate	EMS	22400	Hazardous chemical
Lead citrate	EMS	17900
35mm Gridded coverslip dish	Mattek	P35G-1.5-14-CGRD
Glow discharger	Pelco	easiGlow
Formvar carbon coated Copper Grid	Ted Pella	01805-F
Hydrochloric acid	SIGMA	258148
Fugene HD	Promega	E2311
Glycine	SIGMA	G8898
3,3′ -diaminobenzamidine (DAB)	SIGMA	D8001	Hazardous chemical
30% Hydrogen peroxide solution	Merck	107210
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate	SIGMA	P3289
0.22 um syringe filter	Sartorius	16534
Thiocarbonyldihydrazide	SIGMA	223220	Use only in fume hood
Potassium hydroxide	Fluka	10193426
L-aspartic acid	SIGMA	A9256
Ethanol	Merck	100983
Transmission electron microscopy	FEI	Tecnai G2
Indium tin oxide (ITO) coated glass coverslips	SPI	06489-AB	fragil glass
Isopropanol	Fisher Bioreagents	BP2618-1
Diamond knife	Leica	AT-4
Inveted light microscopy	Nikon	ECLipse TS100
Scanning electron microscopy	Zeiss	Auriga