Immunolabelling Myofiber degenerasjon i muskel biopsier
Summary
Beskrevet her er en protokoll for direkte immunolabelling av nekrotisk myofibers i muskel cryosections. Nekrotisk celler er gjennomtrengelig for serumproteiner, inkludert immunglobulin G (IgG). Avslører opptaket av IgG ved myofibers tillater identifisering og kvantifisering av myofibers som gjennomgår nekrose uavhengig av muskel tilstand.
Abstract
Nekrose av muskelfibre (myonecrosis) spiller en sentral rolle i patogenesen av flere muskel forhold, inkludert muskel dystrofi. Terapeutiske alternativer adressering årsakene til muskel dystrofi patogenesen er ventet å lindre muskel degenerasjon. Derfor en metode for å analysen og kvantifisere omfanget av cellen død i muskel biopsier er nødvendig. Konvensjonelle metoder for å observere myofiber degenerasjon in situ er enten dårlig kvantitative eller stole på injeksjon av vitale fargestoffer. I denne artikkelen er en immunofluorescence protokoll beskrevet som flekker nekrotisk myofibers ved å målrette immunglobulin G (IgG) opptak av myofibers. IgG opptaket metoden er basert på celle funksjoner karakteriserer nekrotisk bortgang, inkludert 1) tap av plasma membran integritet med utgivelsen av skade-tilknyttede molekylære mønstre og 2) opptaket av plasmaproteiner. I murine tverrsnitt, immunolabelling av myofibers, ekstracellulære matrise proteiner, og mus IgG tillater ren og grei identifisering av myofibers med nekrotisk skjebne. Denne enkle metoden er egnet for kvantitativ analyse og gjelder for alle arter, inkludert menneskelige prøver, og krever ikke injeksjon av vitale fargestoff. Farging av nekrotisk myofibers av IgG-opptak kan også pares med andre co-immunolabelling.
Introduction
Striated Skjelettmuskel består hovedsakelig av muskelfibre (myofibers), som er ansvarlig for den karakteristiske frivillige kontraktile funksjon. Disse cellene er multinucleated, post-mitotisk strukturer som støtter mekanisk stress oppstår under sammentrekning. Strukturell stabilitet av myofiber membran (sarcolemma) og dens ekstracellulære matrise er avgjørende for vev homeostase. Satellitt celler utgjør den viktigste muskelen Stam befolkningen i modne skjelettlidelser muskel og finnes i en Quiescent tilstand i sunne muskler. Etter myofiber død, muskel regenerering støttes av satellitt celler etter en myogenic program som involverer satellitt celle aktivering, spredning, differensiering, og fusjon til slutt danne nye multinucleated myofibers.
Myofiber død kan forekomme i flere muskel forhold, inkludert mekaniske traumer, iskemi-reperfusion skader, eller muskuløse dystrofi, og det er forbundet med nekrotisk morfologi av døde celler1,2. Nekrotisk død er karakterisert ved rask permeabilitet av plasma membranen og frigjøring av celleinnhold i ekstracellulære kupé3. Det kan skyldes enten en uregulert prosess som involverer ingen skikkelig celle signal (dvs. utilsiktet nekrose), eller en orkestrert intracellulære veien (dvs. regulert nekrose). I myofibers, både regulert4 og uregulert5 prosesser kan føre til nekrose. En typisk konsekvens av myonecrosis er utgivelsen av skade-forbundet molekyl mønstre, aktivere en kraftig inflammatorisk respons6. Tilstedeværelsen av makrofager er observert på rundt 48 h og 72 h etter skade7. Foruten deres rolle i clearance av nekrotisk rusk, de er også viktig i muskel regenerering8,9.
Muskuløse dystrofi (MDs) er en heterogen gruppe av patologi som ofte skyldes en defekt i sarcolemma struktur. Duchenne muskuløse dystrofi (DMD) er en juvenil X-koblet sykdom som berører ca 1 av hver 3 500 mannlige fødsler over hele verden10, og det er forårsaket av fraværet av dystrofingenet uttrykk på sarcolemma. Kronisk degenerasjon av muskel vev i DMD gutter fører til ekstrem muskelsvakhet og tidlig dødelighet. Betennelse som følge av nekrotisk død forbedrer cytotoksisitet, og fremmer muskel fibrose og tap av muskel funksjon11,12. Behandlinger for tiden i kliniske studier rettet mot røttene av muskel degenerative lidelser, som genterapi, forventes å lindre myonecrosis. Enkle teknikker for å nøyaktig kvantifisere muskel degenerasjon er derfor nødvendig.
Flere metoder brukes rutinemessig til å overvåke myofiber tap in vivo. Målingen av enzymatisk aktivitet av kreatin kinase (CK) i blodet gir pålitelig kvantifisering av pågående nekrose i muskler og hjerte vev. In situ, den haematoxylin og eosin (H & E) farging er den mest populære metoden i dag brukes i diagnosen for å vurdere degenerasjon-regenerering Remodelling. Imidlertid er det molekylære grunnlaget for H & E merking av døde celler uklart. Videre farge modifikasjoner antyder myofiber død i H & E flekker er relativt subtile og ikke rette for pålitelig og reproduserbar kvantifisering. Metoder avslørende DNA fragmentering, slik som Terminal deoksynukleotidyltransferase glutamyltransferase dUTP Nick end merking (TUNEL), ufullkomment Label nekrotisk død3. De er også dårlig tilpasset for å overvåke dødsfallet til syncytial celler som myofibers. Injeksjon av vitale fargestoffer, slik som Evan ‘ s blå fargestoff (EBD), representerer et nyttig alternativ for å vurdere myofibers som har mistet integriteten til sarcolemma, men er ikke nødvendigvis praktisk i noen eksperimentelle protokoller. For eksempel kan tilstedeværelsen av EBD i blodprøver påvirke resultatene av CK målinger, et fargemetrisk analysen. Videre gjør intracellulære opptak av EBD immunolabelling utfordrende. Derfor, en alternativ metode som tillater direkte merking av myofibers gjennomgår nekrose er av interesse.
Virkningsmekanismen av vitale fargestoffer er avhengig av tap av plasma membran integritet i nekrotisk myofibers og passiv opptak av injisert fargestoff. Tilsvarende nekrotisk myofibers opptak Blodproteiner som albumin, der EBD har en sterk affinitet13,14, immunglobulin G (IgG), og IgM15. Den unormale forekomsten av Blodproteiner i myofibers representerer derfor praktiske markører for myonecrosis in situ. Farging av disse proteinene kan være et alternativ for bruk av vitale fargestoffer.
Ved å bruke IgG opptak som en markør for myonecrosis in situ, denne protokollen brukes til å vurdere muskel degenerasjon i tibialispuls fremre (TA) av MDX dystrofingenet-mangelfull mus. Denne metoden presenterer betydelige fordeler fremfor alternative teknikker: 1) det er reproduserbar og enkel i utførelsen sin; 2) det krever ingen dyr behandling før muskel oppsamling, slik som injeksjon av sirkulerende vitale fargestoffer, og 3) som enhver konvensjonell immunolabelling, den er kompatibel med co-merking.
Protocol
Representative Results
Discussion
Myofiber nekrose er en vanlig konsekvens av traumatisk trening i normale muskler. Det er godt kompensert av en kraftig regenererende kapasitet på den lokale muskel forfedre. Men, i flere muskel forhold som i MDs, regenererende kapasitet av satellitt celler er kompromittert av kroniske myonecrosis og overdreven fibrose. Nylige funn viser at muskelfibre kan dø av necroptosis, en regulert form for nekrose. Mer spesifikt kan hemming av necroptosis bli en ny terapeutisk strategi for DMD behandling4. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av foreningen Française contre Les myopatier med Translamuscle programmet. Forfatterne takker Dr. Perla Reyes-Fernandez og Dr. Matthew Borok for deres nøye lesning av manuskriptet.
Materials
| Circular cork disks | Pyramid Innovation | R30001-E | Don't forget to clearly label the cork so that the the ID of the sample can be determined after freezing |
| Cryostat | Leica | CM3050 sn34 | Muscle cryosectionning should be performed between -20 and -25°C. Thickness:7-10 micrometers. |
| Dakopen | Dako | S2002 | A hydrophobic barrier around the muscle sections. It prevents the dispertion of medium during incubation |
| Forceps | FST | 91117-10 | / |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) antibody, Alexa Fluor Plus 488 | ThermoFischer Scientific | A-11029 | Dilution: 1/500 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) antibody Alexa Fluor Plus 594 | ThermoFischer Scientific | A32740 | Dilution: 1/500 |
| Goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | At the blocking step, use 10% dilution in PBS. For antibodies incubation, use 5% dilution in PBS |
| Isopentane | Sigma Aldrich | 78-78-4 | Freezing medium. Should be cooled down in a beaker placed in liquid nitrogen. |
| mdx mouse | Jackson Laboratory | C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J | Mdx mice are mutated for the dystrophin gene. From three weeks of age, muscles are characterized by chronic degeneration |
| Microscope | Zeiss | Imager.D1 | / |
| OCT | Cellpath | KMA-0100-00A | Embedding matrix |
| PFA (Paraformaldehyde) | ThermoFischer Scientific | 28908 | Used for fixing cryosection (2% or 4% PFA can be used) |
| PBS | Eurobio | CS3PBS00-01 | Dilution medium for immunolabeling |
| Precision scisors | FST | fst 14001-12 and fst 14001-14 | Used for the muscle collection |
| Rabbit antibody to mouse pan-Laminin | Sigma Aldrich | L9393 | Dilution: 1/1000 |
| Tragacanth | Sigma Aldrich | G1128 | Aliquots to keep at +4°C |
References
- Carpenter, S., Karpati, G. Duchenne muscular dystrophy: plasma membrane loss initiates muscle cell necrosis unless it is repaired. Brain. 102 (1), 147-161 (1979).
- Cornelio, F., Dones, I. Muscle fiber degeneration and necrosis in muscular dystrophy and other muscle diseases: cytochemical and immunocytochemical data. Annals of Neurology. 16 (6), 694-701 (1984).
- Galluzzi, L., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death and Differerentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).
- Morgan, J. E., et al. Necroptosis mediates myofiber death in dystrophin-deficient mice. Nature Communications. 9 (1), 3655 (2018).
- Moens, P., Baatsen, P. H., Marechal, G. Increased susceptibility of EDL muscles from mdx mice to damage induced by contractions with stretch. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 14 (4), 446-451 (1993).
- Tidball, J. G., Villalta, S. A. Regulatory interactions between muscle and the immune system during muscle regeneration. American Journal of Physiology Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 298 (5), R1173-R1187 (2010).
- Riederer, I., et al. Slowing down differentiation of engrafted human myoblasts into immunodeficient mice correlates with increased proliferation and migration. Molecular Therapy. 20 (1), 146-154 (2012).
- Arnold, L., et al. Inflammatory monocytes recruited after skeletal muscle injury switch into antiinflammatory macrophages to support myogenesis. Journal of Experimental Medicine. 204 (5), 1057-1069 (2007).
- Bencze, M., et al. Proinflammatory macrophages enhance the regenerative capacity of human myoblasts by modifying their kinetics of proliferation and differentiation. Molecular Therapy. 20 (11), 2168-2179 (2012).
- Moat, S. J., Bradley, D. M., Salmon, R., Clarke, A., Hartley, L. Newborn bloodspot screening for Duchenne muscular dystrophy: 21 years experience in Wales (UK). European Journal of Human Genetics. 21 (10), 1049-1053 (2013).
- Serrano, A. L., Munoz-Canoves, P. Regulation and dysregulation of fibrosis in skeletal muscle. Experimental Cell Research. 316 (18), 3050-3058 (2010).
- Rosenberg, A. S., et al. Immune-mediated pathology in Duchenne muscular dystrophy. Science Translational Medicine. 7 (299), (2015).
- Kobayashi, Y. M., Rader, E. P., Crawford, R. W., Campbell, K. P. Endpoint measures in the mdx mouse relevant for muscular dystrophy pre-clinical studies. Neuromuscular Disorders. 22 (1), 34-42 (2012).
- Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Mollgard, K., Habgood, M. D. Markers for blood-brain barrier integrity: how appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives? Frontiers in Neuroscience. 9. 385, (2015).
- Straub, V., Rafael, J. A., Chamberlain, J. S., Campbell, K. P. Animal models for muscular dystrophy show different patterns of sarcolemmal disruption. Journal of Cell Biology. 139 (2), 375-385 (1997).
- Pastoret, C., Sebille, A. Age-related differences in regeneration of dystrophic (mdx) and normal muscle in the mouse. Muscle and Nerve. 18 (10), 1147-1154 (1995).
- Villalta, S. A., Nguyen, H. X., Deng, B., Gotoh, T., Tidball, J. G. Shifts in macrophage phenotypes and macrophage competition for arginine metabolism affect the severity of muscle pathology in muscular dystrophy. Human Molecular Genetics. 18 (3), 482-496 (2009).
