Иммуномаркировка дегенерации миофибра при биопсии мышц
Summary
Описано здесь протокол для прямой иммуномаркировки некротических миофибы в мышечных криосекциях. Некротические клетки проницаемы белками сыворотки, включая иммуноглобулин G (IgG). Выявление поглощения IgG миофибарами позволяет идентификации и количественной оценки миофидеров, которые проходят некроз независимо от состояния мышц.
Abstract
Некроз мышечных волокон (мионекрез) играет центральную роль в патогенеза нескольких мышечных состояний, включая мышечную дистрофию. Терапевтические варианты решения причин мышечной дистрофии патогенеза, как ожидается, облегчить дегенерацию мышц. Таким образом, метод для оценки и количественной степени смерти клеток в биопсии мышц необходимо. Обычные методы для наблюдения дегенерации миофипла на месте либо плохо количественные или полагаться на инъекции жизненно важных красителей. В этой статье описывается протокол иммунофлуоресценции, который окрашивает некротические миофиберы, нацеливая на иммуноглобулин G (IgG) поглощение миофиберами. Метод поглощения IgG основан на клеточных особенностях, характеризующих некротическую кончину, включая 1) потерю целостности плазменной мембраны с высвобожденными молекулярными паттернами, связанными с ущербом, и 2) поглощением плазменных белков. В поперечных сечениях, совместноиммуномаркировки миофиберов, внеклеточных матричных белков, и мыши IgG позволяет чистой и прямой идентификации миофиберов с некротической судьбой. Этот простой метод подходит для количественного анализа и применим ко всем видам, включая образцы человека, и не требует инъекций жизненно важного красителя. Окрашивание некротических миофиберов поглощением IgG также может быть сопряжено с другими совместно иммуномаркировки.
Introduction
Стриженные скелетные мышцы в основном состоят из мышечных волокон (миофибы), которые отвечают за характерную добровольную контрактную функцию. Эти клетки многоядерных, пост-митотических структур, которые поддерживают механический стресс, происходящих во время сокращения. Структурная стабильность мембраны миофибра (саркольма) и ее внеклеточной матрицы имеют решающее значение для ткани гомеостаза. Спутниковые клетки составляют основную популяцию предтека мышц в зрелой скелетной мышце и существуют в состоянии покоя в здоровых мышцах. После смерти миофибра, регенерация мышц поддерживается спутниковыми клетками после миогенной программы, которая включает в себя активацию спутниковых клеток, пролиферацию, дифференциацию и синтез, чтобы в конечном итоге сформировать новые многоядерные миофибы.
Миофибра кончина может произойти в нескольких мышечных условиях, в том числе механические травмы, ишемия-реперфузии травм, или мышечной дистрофии, и это связано с некротической морфологии мертвых клеток1,2. Некротическая смерть характеризуется быстрой проницаемостью плазменной мембраны и высвобождением клеточного содержания в внеклеточном отсеке3. Это может быть результатом либо нерегулируемого процесса, не включающего надлежащей сигнализации клеток (т.е. случайного некроза), либо организованного внутриклеточного пути (т.е. регулируемого некроза). В миофидерах, как регулируемые4, так и нерегулируемые5 процессов могут привести к некрозу. Типичным следствием мионекроза является высвобождение связанных с повреждением молекул, активируя мощный воспалительный ответ6. Присутствие макрофагов наблюдается на уровне около 48 ч и 72 ч после травмы7. Помимо своей роли в расчистке некротического мусора, они также играют важную роль в регенерации мышц8,9.
Мышечные дистрофии (МД) представляют собой неоднородную группу патологий, которые часто являются результатом дефекта в структуре сарколеммы. Мышечная дистрофия Дюшенна (DMD) является несовершеннолетним X-связанных заболеваний, затрагивающих примерно 1 из каждых 3500 мужских рождений во всем мире10, и это вызвано отсутствием экспрессии дистрофина в сарколемме. Хроническая дегенерация мышечной ткани у мальчиков DMD приводит к крайней мышечной слабости и ранней смертности. Воспаление в результате некротической смерти повышает цитотоксичность, и способствует мышечный фиброз и потеря мышечной функции11,12. Лечение в настоящее время в клинических испытаниях ориентации корни мышечных дегенеративных расстройств, таких как генная терапия, как ожидается, облегчить мионекрез. Простые методы для точной количественной оценки мышечной дегенерации, следовательно, необходимы.
Несколько методов обычно используются для мониторинга потери миофибра in vivo. Измерение ферментативной активности креатина киназы (КК) в крови позволяет надежно очислить продолжающийся некроз в мышечных и сердечных тканях. На месте, гематоксилин и эозин (H и E) окрашивание является наиболее популярным методом в настоящее время используется в диагностике для оценки дегенерации регенерации ремоделирования. Тем не менее, молекулярная основа маркировки Н И Е мертвых клеток остается неясной. Кроме того, цветовые изменения, предполагающие смерть миофибра при окрашивании Н и Е, являются относительно тонкими и не способствуют надежной и воспроизводимой количественной оценке. Методы выявления фрагментации ДНК, такие как терминал deoxynucleotidyl transferase dUTP ник конец маркировки (TUNEL), несовершенно ярлык некротической смерти3. Они также плохо приспособлены для мониторинга смерти синцитиальных клеток, таких как миофибы. Инъекции жизненно важных красителей, таких как синий краситель Эвана (EBD), представляет собой полезную альтернативу для оценки миофиберов, которые потеряли целостность сарколеммы, но не обязательно удобно в некоторых экспериментальных протоколов. Например, наличие EBD в образцах крови может повлиять на результаты измерений CK, колористетрического анализа. Кроме того, внутриклеточного поглощения EBD делает совместноиммуномаркировки сложной задачей. Таким образом, представляет интерес альтернативный метод, позволяющий прямое маркировка миофибы, проходящих некроз.
Механизм действия жизненно важных красителей зависит от потери целостности плазменной мембраны в некротических миофимерах и пассивного поглощения инъекционного красителя. Аналогичным образом, некротические миофиберы усваивают белки крови, такие как альбумин, для которого EBD имеет сильное сродство13,14, иммуноглобулин G (IgG), и IgM15. Ненормальное присутствие белков крови в myofibers поэтому представляет собой удобные маркеры для мионекроза на месте. Окрашивание этих белков может быть альтернативой для использования жизненно важных красителей.
Используя поглощение IgG в качестве маркера мионекроза на месте, этот протокол используется для оценки мышечной дегенерации в передней tibialis (TA) mdx dystrophin-дефицитных мышей. Этот метод представляет значительные преимущества перед альтернативными методами: 1) он воспроизводим и прост в своем исполнении; 2) он не требует лечения животных до сбора мышц, таких как инъекция циркулирующих жизненно важных красителей, и 3) как любой обычный иммуномаркировки, он совместим с совместной маркировки.
Protocol
Representative Results
Discussion
Миофибр некроз является общим следствием травматических упражнений в нормальных мышцах. Он хорошо компенсируется мощной регенеративной способностью местных мышечных прародителей. Однако, в нескольких мышечных условиях, таких как в MDs, регенеративная способность спутниковых клеток с…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Ассоциацией Франсез contre les Myopathies с программой Translamuscle. Авторы благодарят д-ра Перлу Рейес-Фернандес и доктора Мэтью Борока за тщательное прочтение рукописи.
Materials
| Circular cork disks | Pyramid Innovation | R30001-E | Don't forget to clearly label the cork so that the the ID of the sample can be determined after freezing |
| Cryostat | Leica | CM3050 sn34 | Muscle cryosectionning should be performed between -20 and -25°C. Thickness:7-10 micrometers. |
| Dakopen | Dako | S2002 | A hydrophobic barrier around the muscle sections. It prevents the dispertion of medium during incubation |
| Forceps | FST | 91117-10 | / |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) antibody, Alexa Fluor Plus 488 | ThermoFischer Scientific | A-11029 | Dilution: 1/500 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) antibody Alexa Fluor Plus 594 | ThermoFischer Scientific | A32740 | Dilution: 1/500 |
| Goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | At the blocking step, use 10% dilution in PBS. For antibodies incubation, use 5% dilution in PBS |
| Isopentane | Sigma Aldrich | 78-78-4 | Freezing medium. Should be cooled down in a beaker placed in liquid nitrogen. |
| mdx mouse | Jackson Laboratory | C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J | Mdx mice are mutated for the dystrophin gene. From three weeks of age, muscles are characterized by chronic degeneration |
| Microscope | Zeiss | Imager.D1 | / |
| OCT | Cellpath | KMA-0100-00A | Embedding matrix |
| PFA (Paraformaldehyde) | ThermoFischer Scientific | 28908 | Used for fixing cryosection (2% or 4% PFA can be used) |
| PBS | Eurobio | CS3PBS00-01 | Dilution medium for immunolabeling |
| Precision scisors | FST | fst 14001-12 and fst 14001-14 | Used for the muscle collection |
| Rabbit antibody to mouse pan-Laminin | Sigma Aldrich | L9393 | Dilution: 1/1000 |
| Tragacanth | Sigma Aldrich | G1128 | Aliquots to keep at +4°C |
References
- Carpenter, S., Karpati, G. Duchenne muscular dystrophy: plasma membrane loss initiates muscle cell necrosis unless it is repaired. Brain. 102 (1), 147-161 (1979).
- Cornelio, F., Dones, I. Muscle fiber degeneration and necrosis in muscular dystrophy and other muscle diseases: cytochemical and immunocytochemical data. Annals of Neurology. 16 (6), 694-701 (1984).
- Galluzzi, L., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death and Differerentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).
- Morgan, J. E., et al. Necroptosis mediates myofiber death in dystrophin-deficient mice. Nature Communications. 9 (1), 3655 (2018).
- Moens, P., Baatsen, P. H., Marechal, G. Increased susceptibility of EDL muscles from mdx mice to damage induced by contractions with stretch. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 14 (4), 446-451 (1993).
- Tidball, J. G., Villalta, S. A. Regulatory interactions between muscle and the immune system during muscle regeneration. American Journal of Physiology Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 298 (5), R1173-R1187 (2010).
- Riederer, I., et al. Slowing down differentiation of engrafted human myoblasts into immunodeficient mice correlates with increased proliferation and migration. Molecular Therapy. 20 (1), 146-154 (2012).
- Arnold, L., et al. Inflammatory monocytes recruited after skeletal muscle injury switch into antiinflammatory macrophages to support myogenesis. Journal of Experimental Medicine. 204 (5), 1057-1069 (2007).
- Bencze, M., et al. Proinflammatory macrophages enhance the regenerative capacity of human myoblasts by modifying their kinetics of proliferation and differentiation. Molecular Therapy. 20 (11), 2168-2179 (2012).
- Moat, S. J., Bradley, D. M., Salmon, R., Clarke, A., Hartley, L. Newborn bloodspot screening for Duchenne muscular dystrophy: 21 years experience in Wales (UK). European Journal of Human Genetics. 21 (10), 1049-1053 (2013).
- Serrano, A. L., Munoz-Canoves, P. Regulation and dysregulation of fibrosis in skeletal muscle. Experimental Cell Research. 316 (18), 3050-3058 (2010).
- Rosenberg, A. S., et al. Immune-mediated pathology in Duchenne muscular dystrophy. Science Translational Medicine. 7 (299), (2015).
- Kobayashi, Y. M., Rader, E. P., Crawford, R. W., Campbell, K. P. Endpoint measures in the mdx mouse relevant for muscular dystrophy pre-clinical studies. Neuromuscular Disorders. 22 (1), 34-42 (2012).
- Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Mollgard, K., Habgood, M. D. Markers for blood-brain barrier integrity: how appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives? Frontiers in Neuroscience. 9. 385, (2015).
- Straub, V., Rafael, J. A., Chamberlain, J. S., Campbell, K. P. Animal models for muscular dystrophy show different patterns of sarcolemmal disruption. Journal of Cell Biology. 139 (2), 375-385 (1997).
- Pastoret, C., Sebille, A. Age-related differences in regeneration of dystrophic (mdx) and normal muscle in the mouse. Muscle and Nerve. 18 (10), 1147-1154 (1995).
- Villalta, S. A., Nguyen, H. X., Deng, B., Gotoh, T., Tidball, J. G. Shifts in macrophage phenotypes and macrophage competition for arginine metabolism affect the severity of muscle pathology in muscular dystrophy. Human Molecular Genetics. 18 (3), 482-496 (2009).
