Inmunoetiquetado Desgeneración de miofibra en biopsias musculares
Summary
Aquí se describe un protocolo para el inmunoetiquetado directo de miofibers necróticas en criosecciones musculares. Las células necróticas son permeables a las proteínas séricas, incluyendo la inmunoglobulina G (IgG). Revelar la aceptación de IgG por miofibers permite la identificación y cuantificación de miofibers que sufren necrosis independientemente de la condición muscular.
Abstract
La necrosis de las fibras musculares (mionecrosis) desempeña un papel central en la patogénesis de varias afecciones musculares, incluyendo distrofias musculares. Se espera que las opciones terapéuticas que abordan las causas de la patogénesis de la distrofia muscular alivien la degeneración muscular. Por lo tanto, se necesita un método para determinar y cuantificar el alcance de la muerte celular en las biopsias musculares. Los métodos convencionales para observar la degeneración de la miofibra in situ son poco cuantitativos o dependen de la inyección de distos vitales. En este artículo, se describe un protocolo de inmunofluorescencia que mancha las miofibers necróticas al atacar la admisa de inmunoglobulina G (IgG) por miofibers. El método de admisión de IgG se basa en características celulares que caracterizan la muerte necrótica, incluyendo 1) la pérdida de integridad de la membrana plasmática con la liberación de patrones moleculares asociados al daño y 2) la adopción de proteínas plasmáticas. En las secciones transversales murinas, el co-inmunoetiquetado de miofibers, proteínas de matriz extracelular e IgG de ratón permite una identificación limpia y directa de las miofibers con el destino necrótico. Este método simple es adecuado para el análisis cuantitativo y aplicable a todas las especies, incluidas las muestras humanas, y no requiere la inyección de tinte vital. La tinción de miofibers necróticas por la suación de IgG también se puede emparejar con otro co-inmunoetiquetado.
Introduction
El músculo esquelético estriado consiste principalmente en fibras musculares (miofibers), que son responsables de la característica función contráctile voluntaria. Estas células son estructuras multinucleadas y postmitoticas que soportan el estrés mecánico que ocurre durante la contracción. La estabilidad estructural de la membrana de la miofiber (sarcolemma) y su matriz extracelular son cruciales para la homeostasis tisular. Las células satélite comprenden la población principal de progenitores musculares en el músculo esquelético maduro y existen en un estado de reposo en músculos sanos. Después de la muerte de la miofibra, la regeneración muscular es apoyada por células satélite después de un programa miogénico que implica activación de células satelitales, proliferación, diferenciación y fusión para, en última instancia, formar nuevas miofibers multinucleadas.
La miofibra la muerte puede ocurrir en múltiples condiciones musculares, incluyendo trauma mecánico, lesiones de isquemia-reperfusión, o distrofias musculares, y se asocia con la morfología necrótica de las células muertas1,2. La muerte necrótica se caracteriza por la rápida permeabilidad de la membrana plasmática y la liberación del contenido celular en el compartimiento extracelular3. Puede ser el resultado de un proceso no regulado que no implica señalización celular adecuada (es decir, necrosis accidental), o de una vía intracelular orquestada (es decir, necrosis regulada). En la miofibras, tanto los procesosregulados 4 comolos 5 no regulados pueden conducir a la necrosis. Una consecuencia típica de la mionecrosis es la liberación de patrones de moléculas asociadas al daño, activando una potente respuesta inflamatoria6. La presencia de macrófagos se observa alrededor de 48 h y 72 h después de una lesión7. Además de su papel en el aclaramiento de escombros necróticos, también son importantes en la regeneración muscular8,9.
Las distrofias musculares (MID) son un grupo heterogéneo de patologías que a menudo resultan de un defecto en la estructura del sarcolemma. La distrofia muscular de Duchenne (DMD) es una enfermedad juvenil ligada al X que afecta aproximadamente a 1 de cada 3.500 nacimientos masculinos en todo el mundo10,y es causada por la ausencia de expresión de distrofina en el sarcolemma. La degeneración crónica del tejido muscular en los niños DMD conduce a la debilidad muscular extrema y la mortalidad temprana. La inflamación resultante de la muerte necrótica mejora la citotoxicidad, y promueve la fibrosis muscular y la pérdida de la función muscular11,12. Se espera que los tratamientos actualmente en ensayos clínicos dirigidos a las raíces de los trastornos degenerativos musculares, como la terapia génica, alivien la mionecrosis. Por lo tanto, se necesitan técnicas simples para cuantificar con precisión la degeneración muscular.
Varios métodos se utilizan rutinariamente para controlar la pérdida de miofibra in vivo. La medición de la actividad enzimática de la creatina quinasa (CK) en la sangre permite una cuantificación fiable de la necrosis continua en los tejidos musculares y cardíacos. In situ, la tinción de hemexilina y eosina (H&E) es el método más popular que se utiliza actualmente en el diagnóstico para evaluar la remodelación de la degeneración-regeneración. Sin embargo, la base molecular del etiquetado H&E de las células muertas sigue sin estar clara. Además, las modificaciones de color que sugieren la muerte de miofibra en la tinción de H&E son relativamente sutiles y no facilitan la cuantificación fiable y reproducible. Métodos que revelan la fragmentación del ADN, como el etiquetado terminal de desoxinucleorden de la transferencia dUTP (TUNEL), etiqueta imperfectamente la muerte necrótica3. También están mal adaptados para monitorear la muerte de células sincitiales como la miofibras. La inyección de tintes vitales, como el tinte azul (EBD) de Evan, representa una alternativa útil para evaluar las miofibers que han perdido la integridad del sarcolemma, pero no es necesariamente conveniente en algunos protocolos experimentales. Por ejemplo, la presencia de EBD en muestras de sangre puede afectar a los resultados de las mediciones de CK, un ensayo colorimétrico. Además, la ingesta intracelular de EBD dificulta el co-inmunoetiquetado. Por lo tanto, un método alternativo que permite el etiquetado directo de miofibers sometidos a necrosis es de interés.
El mecanismo de acción de los tintes vitales se basa en la pérdida de la integridad de la membrana plasmática en las miofibers necróticas y la aceptación pasiva del tinte inyectado. Del mismo modo, las miofibers necróticas toman proteínas de la sangre como la albúmina, para la que EBD tiene una fuerte afinidad13,14,inmunoglobulina G (IgG) e IgM15. Por lo tanto, la presencia anormal de proteínas sanguíneas dentro de las miofibers representa marcadores convenientes para la mionecrosis in situ. La tinción de estas proteínas puede ser una alternativa para el uso de colorantes vitales.
Mediante el uso de la ingesta de IgG como un marcador de mionecrosis in situ, este protocolo se utiliza para evaluar la degeneración muscular en los tibialis anterior (TA) de ratones con deficiencia de distrofina mdx. Este método presenta ventajas significativas sobre las técnicas alternativas: 1) es reproducible y simple en su ejecución; 2) no requiere ningún tratamiento animal antes de la recolección muscular, como la inyección de dedos vitales circulantes, y 3) como cualquier inmunoetiquetado convencional, es compatible con el etiquetado cooperativo.
Protocol
Representative Results
Discussion
La necrosis de miofibra es una consecuencia común del ejercicio traumático en los músculos normales. Está bien compensado por una poderosa capacidad regenerativa de los progenitores musculares locales. Sin embargo, en varias condiciones musculares como en los D, la capacidad regenerativa de las células satélite se ve comprometida por la mionecrosis crónica y la fibrosis excesiva. Los hallazgos recientes muestran que las fibras musculares pueden morir por necroptosis, una forma regulada de necrosis. Más específic…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Asociación Francesa contre les Myopathies con el programa Translamuscle. Los autores agradecen al Dr. Perla Reyes-Fernandez y al Dr. Matthew Borok por su cuidadosa lectura del manuscrito.
Materials
| Circular cork disks | Pyramid Innovation | R30001-E | Don't forget to clearly label the cork so that the the ID of the sample can be determined after freezing |
| Cryostat | Leica | CM3050 sn34 | Muscle cryosectionning should be performed between -20 and -25°C. Thickness:7-10 micrometers. |
| Dakopen | Dako | S2002 | A hydrophobic barrier around the muscle sections. It prevents the dispertion of medium during incubation |
| Forceps | FST | 91117-10 | / |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) antibody, Alexa Fluor Plus 488 | ThermoFischer Scientific | A-11029 | Dilution: 1/500 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) antibody Alexa Fluor Plus 594 | ThermoFischer Scientific | A32740 | Dilution: 1/500 |
| Goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | At the blocking step, use 10% dilution in PBS. For antibodies incubation, use 5% dilution in PBS |
| Isopentane | Sigma Aldrich | 78-78-4 | Freezing medium. Should be cooled down in a beaker placed in liquid nitrogen. |
| mdx mouse | Jackson Laboratory | C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J | Mdx mice are mutated for the dystrophin gene. From three weeks of age, muscles are characterized by chronic degeneration |
| Microscope | Zeiss | Imager.D1 | / |
| OCT | Cellpath | KMA-0100-00A | Embedding matrix |
| PFA (Paraformaldehyde) | ThermoFischer Scientific | 28908 | Used for fixing cryosection (2% or 4% PFA can be used) |
| PBS | Eurobio | CS3PBS00-01 | Dilution medium for immunolabeling |
| Precision scisors | FST | fst 14001-12 and fst 14001-14 | Used for the muscle collection |
| Rabbit antibody to mouse pan-Laminin | Sigma Aldrich | L9393 | Dilution: 1/1000 |
| Tragacanth | Sigma Aldrich | G1128 | Aliquots to keep at +4°C |
References
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