Immunolabelling myofiber degeneration i Muskelbiopsier
Summary
Beskrivs här är ett protokoll för direkt immunolabelling av nekrotiska myofibers i muskel kryosektioner. Nekrotiska celler är permeabla för serumproteiner, inklusive immunglobulin G (IgG). Avslöjar upptaget av IgG av myofibers möjliggör identifiering och kvantifiering av myofibers som genomgår nekros oavsett muskel tillstånd.
Abstract
Den nekros av muskelfibrer (myonecrosis) spelar en central roll i patogenesen av flera muskelsjukdomar, inklusive muskeldystrophies. Terapeutiska alternativ som behandlar orsakerna till muskeldystrofi patogenes förväntas lindra muskel degeneration. Därför behövs en metod för att analys och kvantifiera omfattningen av celldöd i Muskelbiopsier. Konventionella metoder för att observera myofiber degeneration in situ är antingen dåligt kvantitativa eller förlita sig på injektion av vitala färgämnen. I denna artikel, en immunofluorescensprotokoll beskrivs som fläckar nekrotiska myofibers genom att rikta immunglobulin G (IgG) upptag av myofibers. IgG upptagnings metoden baseras på Cellegenskaper som kännetecknar nekrotisk död, inklusive 1) förlusten av plasmamembran integritet med frisättning av skadeassocierade molekylära mönster och 2) upptag av plasmatiska proteiner. I murina tvärsnitt, Co-immunolabelling av myofibers, extracellulära matrix proteiner, och mus IgG tillåter ren och enkel identifiering av myofibers med nekrotisk öde. Denna enkla metod lämpar sig för kvantitativ analys och gäller för alla arter, inklusive mänskliga prover, och kräver inte injektion av vitala färgämnen. Färgning av nekrotiska myofibers av IgG upptag kan också paras ihop med andra samtidig immunolabelling.
Introduction
Tvärstrimmig skelettmuskulaturen består huvudsakligen av muskelfibrer (myofibers), som är ansvariga för den karakteristiska frivilliga kontraktila funktion. Dessa celler är multinucleated, post-mitotiska strukturer som stöder mekanisk stress inträffar under kontraktion. Strukturell stabilitet av myofiber membranet (sarcolemma) och dess extracellulära matris är avgörande för vävnad homeostas. Satellit celler utgör den viktigaste muskeln stamfader i mogna skelett muskler och finns i en quiescent tillstånd i friska muskler. Efter myofiber död, muskel förnyelse stöds av satellit celler efter en Myogenic program som involverar satellit cell aktivering, proliferation, differentiering, och fusion att slutligen bilda nya flerkärniga myofibers.
Myofiber nedläggningen kan förekomma i flera muskel förhållanden, inklusive mekaniska trauma, ischemia-reperfusion skador, eller muskeldystrophies, och det är förknippat med den nekrotiska morfologin av döda celler1,2. Nekrotisk död kännetecknas av den snabba permeabiliteten i plasmamembranet och frisättning av cellinnehåll i extracellulära facket3. Det kan bero på antingen en oreglerad process som inte innebär någon ordentlig cellsignalering (dvs. oavsiktlig nekros), eller en orkeslerad intracellulär väg (dvs., reglerad nekros). I myofibers, både reglerade4 och oreglerade5 processer kan leda till nekros. En typisk följd av myonecrosis är frisläppandet av skadeassocierade molekyl mönster, aktivera ett kraftfullt inflammatoriskt svar6. Närvaron av makrofager observeras vid cirka 48 h och 72 h efter skada7. Förutom sin roll i clearance av nekrotisk skräp, de är också viktiga i muskel förnyelse8,9.
Muskeldystrofier (MDs) är en heterogen grupp av patologier som ofta beror på en defekt i sarcolemma struktur. Duchennes muskeldystrofi (DMD) är en juvenil X-länkade sjukdom som drabbar cirka 1 av varje 3 500 manliga födslar över hela världen10, och det orsakas av frånvaron av dystrofin uttryck vid sarcolemma. Kronisk degeneration av muskelvävnad i DMD pojkar leder till extrem muskelsvaghet och tidig dödlighet. Inflammation till följd av nekrotisk död ökar cytotoxicitet, och främjar muskel fibros och förlusten av muskelfunktion11,12. Behandlingar som för närvarande i kliniska prövningar som riktar sig till rötterna av muskel degenerativa sjukdomar, såsom genterapi, förväntas lindra myonecrosis. Enkla tekniker för att exakt kvantifiera muskel degeneration behövs därför.
Flera metoder används rutinmässigt för att övervaka myofiber förlust in vivo. Mätningen av den enzymatiska aktiviteten av kreatinkinas (CK) i blodet möjliggör tillförlitlig kvantifiering av pågående nekros i muskel-och hjärtvävnad. In situ, den hematoxylin och eosin (H & E) färgning är den mest populära metoden som för närvarande används i diagnosen för att bedöma degeneration-Regeneration Remodelling. Den molekylära grunden för H & E-märkningen av döda celler är dock fortfarande oklar. Dessutom, färgändringar tyder myofiber död i H & E färgning är relativt subtila och inte underlättar tillförlitlig och reproducerbar kvantifiering. Metoder som avslöjar DNA-fragmentering, såsom terminalen deoxynucleotidyltransferas dUTP Nick end märkning (TUNEL), ofullständigt etikett nekrotisk död3. De är också dåligt anpassade för att övervaka död syncytial celler såsom myofibers. Injektionen av vitala färgämnen, såsom Evan ‘ s Blue Dye (EBD), representerar ett användbart alternativ för att bedöma myofibers som har förlorat integriteten av sarcolemma, men är inte nödvändigtvis bekvämt i vissa experimentella protokoll. Till exempel kan närvaron av EBD i blodprov påverka resultaten av CK-mätningar, en kolorimetrisk analys. Dessutom gör intracellulärt upptag av EBD Co-immunolabelling utmanande. Därför är en alternativ metod som möjliggör direkt märkning av myofibers som genomgår nekros av intresse.
Verkningsmekanismen av vitala färgämnen förlitar sig på förlusten av plasmamembranet integritet i nekrotiska myofibers och passiv upptag av det injicerade färgämnet. Likaså, nekrotiska myofibers upptag blodproteiner såsom albumin, för vilka EBD har en stark affinitet13,14, immunglobulin G (IgG), och IgM15. Den onormala närvaron av blodproteiner inom myofibers representerar därför bekväma markörer för myonecrosis in situ. Färgning dessa proteiner kan vara ett alternativ för användning av vitala färgämnen.
Genom att använda IgG upptag som markör för myonecrosis in situ, detta protokoll används för att bedöma muskel degeneration i tibialis anterior (TA) av MDX Dystrophin-bristfällig möss. Denna metod ger betydande fördelar jämfört med alternativa tekniker: 1) den är reproducerbar och enkel i utförandet; 2) det kräver inte någon djur behandling före muskel uppsamling, såsom injektion av cirkulerande vitala färgämnen, och 3) som en konventionell immunolabelling, det är förenligt med co-märkning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Myofiber nekros är en vanlig följd av traumatisk övning i normala muskler. Den är väl kompenserad av en kraftfull regenerativ kapacitet hos de lokala muskel progenitorerna. Emellertid, i flera muskel tillstånd som i MDs, regenerativ kapacitet av satellit celler äventyras av kronisk myonecrosis och överdriven fibros. De senaste rönen visar att muskelfibrer kan dö genom nekroptos, en reglerad form av nekros. Mer specifikt kan hämning av necroptos bli en ny terapeutisk strategi för DMD behandling<sup class="xref…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av föreningen française contre Les Myopathies med Translamuscle programmet. Författarna tackar Dr Perla Reyes-Fernandez och Dr Matthew Borok för deras noggranna läsning av manuskriptet.
Materials
| Circular cork disks | Pyramid Innovation | R30001-E | Don't forget to clearly label the cork so that the the ID of the sample can be determined after freezing |
| Cryostat | Leica | CM3050 sn34 | Muscle cryosectionning should be performed between -20 and -25°C. Thickness:7-10 micrometers. |
| Dakopen | Dako | S2002 | A hydrophobic barrier around the muscle sections. It prevents the dispertion of medium during incubation |
| Forceps | FST | 91117-10 | / |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) antibody, Alexa Fluor Plus 488 | ThermoFischer Scientific | A-11029 | Dilution: 1/500 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) antibody Alexa Fluor Plus 594 | ThermoFischer Scientific | A32740 | Dilution: 1/500 |
| Goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | At the blocking step, use 10% dilution in PBS. For antibodies incubation, use 5% dilution in PBS |
| Isopentane | Sigma Aldrich | 78-78-4 | Freezing medium. Should be cooled down in a beaker placed in liquid nitrogen. |
| mdx mouse | Jackson Laboratory | C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J | Mdx mice are mutated for the dystrophin gene. From three weeks of age, muscles are characterized by chronic degeneration |
| Microscope | Zeiss | Imager.D1 | / |
| OCT | Cellpath | KMA-0100-00A | Embedding matrix |
| PFA (Paraformaldehyde) | ThermoFischer Scientific | 28908 | Used for fixing cryosection (2% or 4% PFA can be used) |
| PBS | Eurobio | CS3PBS00-01 | Dilution medium for immunolabeling |
| Precision scisors | FST | fst 14001-12 and fst 14001-14 | Used for the muscle collection |
| Rabbit antibody to mouse pan-Laminin | Sigma Aldrich | L9393 | Dilution: 1/1000 |
| Tragacanth | Sigma Aldrich | G1128 | Aliquots to keep at +4°C |
References
- Carpenter, S., Karpati, G. Duchenne muscular dystrophy: plasma membrane loss initiates muscle cell necrosis unless it is repaired. Brain. 102 (1), 147-161 (1979).
- Cornelio, F., Dones, I. Muscle fiber degeneration and necrosis in muscular dystrophy and other muscle diseases: cytochemical and immunocytochemical data. Annals of Neurology. 16 (6), 694-701 (1984).
- Galluzzi, L., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death and Differerentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).
- Morgan, J. E., et al. Necroptosis mediates myofiber death in dystrophin-deficient mice. Nature Communications. 9 (1), 3655 (2018).
- Moens, P., Baatsen, P. H., Marechal, G. Increased susceptibility of EDL muscles from mdx mice to damage induced by contractions with stretch. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 14 (4), 446-451 (1993).
- Tidball, J. G., Villalta, S. A. Regulatory interactions between muscle and the immune system during muscle regeneration. American Journal of Physiology Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 298 (5), R1173-R1187 (2010).
- Riederer, I., et al. Slowing down differentiation of engrafted human myoblasts into immunodeficient mice correlates with increased proliferation and migration. Molecular Therapy. 20 (1), 146-154 (2012).
- Arnold, L., et al. Inflammatory monocytes recruited after skeletal muscle injury switch into antiinflammatory macrophages to support myogenesis. Journal of Experimental Medicine. 204 (5), 1057-1069 (2007).
- Bencze, M., et al. Proinflammatory macrophages enhance the regenerative capacity of human myoblasts by modifying their kinetics of proliferation and differentiation. Molecular Therapy. 20 (11), 2168-2179 (2012).
- Moat, S. J., Bradley, D. M., Salmon, R., Clarke, A., Hartley, L. Newborn bloodspot screening for Duchenne muscular dystrophy: 21 years experience in Wales (UK). European Journal of Human Genetics. 21 (10), 1049-1053 (2013).
- Serrano, A. L., Munoz-Canoves, P. Regulation and dysregulation of fibrosis in skeletal muscle. Experimental Cell Research. 316 (18), 3050-3058 (2010).
- Rosenberg, A. S., et al. Immune-mediated pathology in Duchenne muscular dystrophy. Science Translational Medicine. 7 (299), (2015).
- Kobayashi, Y. M., Rader, E. P., Crawford, R. W., Campbell, K. P. Endpoint measures in the mdx mouse relevant for muscular dystrophy pre-clinical studies. Neuromuscular Disorders. 22 (1), 34-42 (2012).
- Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Mollgard, K., Habgood, M. D. Markers for blood-brain barrier integrity: how appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives? Frontiers in Neuroscience. 9. 385, (2015).
- Straub, V., Rafael, J. A., Chamberlain, J. S., Campbell, K. P. Animal models for muscular dystrophy show different patterns of sarcolemmal disruption. Journal of Cell Biology. 139 (2), 375-385 (1997).
- Pastoret, C., Sebille, A. Age-related differences in regeneration of dystrophic (mdx) and normal muscle in the mouse. Muscle and Nerve. 18 (10), 1147-1154 (1995).
- Villalta, S. A., Nguyen, H. X., Deng, B., Gotoh, T., Tidball, J. G. Shifts in macrophage phenotypes and macrophage competition for arginine metabolism affect the severity of muscle pathology in muscular dystrophy. Human Molecular Genetics. 18 (3), 482-496 (2009).
