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생화학

원형 RNA를 분석하기 위해 미니유전자를 포함하는 Alu 요소 사용

Published: March 10, 2020
doi:
10.3791/59760
, , ,
1Institute for Molecular and Cellular Biochemistry,University of Kentucky

Summary

우리는 원형 RNA를 생성하는 리포터 유전자를 복제하고 분석합니다. 이러한 리포터 유전자는 선형 접합을 분석하고 Alu 요소를 포함하는 구성물보다 큽합니다. 원형 RNA를 조사하기 위하여는, 구조물은 세포로 형질 감염되고 결과 RNA는 선형 RNA의 제거 후에 RT-PCR를 사용하여 분석됩니다.

Abstract

선형 mRNA 이외에, 많은 진핵 유전자는 원형 RNA를 생성합니다. 대부분의 원형 RNA는 5′ 스플라이스 사이트와 사전 mRNA 내의 스플라이스 사이트, 백 스플라이싱이라는 프로세스를 결합하여 생성됩니다. 이 순환은 스플라이스 사이트를 근접으로 가져오는 pre-mRNA에 있는 이차 구조물에 의해 아마 원조됩니다. 인간 유전자에서, Alu 요소는 이러한 이차 RNA 구조를 촉진하는 것으로 생각된다, 알루 요소는 풍부하고 사전 mRNA에서 반대 방향으로 존재 할 때 서로 기본 상보성을 전시. 여기서, 우리는 원형 RNA를 형성하는 리포터 유전자를 포함하는 큰, Alu 요소의 생성 및 분석을 기술한다. 복제 프로토콜의 최적화를 통해 최대 20kb 의 삽입 길이의 리포터 유전자를 생성할 수 있습니다. 공동 형질감염 실험에서의 분석을 통해 규제 요인을 식별할 수 있습니다. 따라서, 이 방법은 원형 RNA 형성에 관여하는 RNA 서열 및 세포 성분을 식별할 수 있다.

Introduction

원형 RNA
원형 RNA (circRNAs)는 대부분의 유기체에서 발현되는 공유폐쇄된 단일 가닥 RNA입니다. 이들은 다운스트림 5′ 스플라이스 사이트를 업스트림 3′ 스플라이스 사이트로 결합하여 생성되며, 백스플라이싱(그림1A)이라고불리는 프로세스입니다. 30-40 nt만큼 짧은 염기 상보를 나타내는 pre-mRNA의 서열은 circRNA 형성을 위한 적당한 정렬로 역 스플라이스 사이트를가져온다 2. 인간에서, 알루 원소1은,게놈3의약 11%를 나타내며, 그들의 자기 상보성4,5로 인해 pre-mRNA에서 광범위한 이중 좌초 RNA 구조를 형성하고 따라서 circRNAs1의형성을 촉진한다.

현재, circRNAs의 3개의 중요한 기능은 기술되었습니다. 일부 circRNAs 는 miRNA (miRNAs)를 결합하고 miRNA 스폰지6과같은 격리 행위를 통해 . CircRNAs는 전사 및 사후 전사 조절에 연루되어 있으며, 선형 접합7과의 경쟁 또는 전사 인자 활성의 변조를 통해8. 마지막으로, circRNAs는 짧은 오픈 독서 프레임과 원리 연구의 증거를 포함 그들은9,10번역 될 수 있음을 보여줍니다 . 그러나 대부분의 circRNAs의 기능은 수수께끼로 남아 있습니다. 원형 RNA의 대부분은 차세대 염기서열 분석법11을사용하여 검출되었습니다. 표적으로 한 RT-PCR 접근을 사용하여 개별 적인 유전자의 상세한 분석은 원형 RNA의 다수가 발견될 남아 있다는 것을12를밝힙입니다.

리포터 유전자를 사용하여 전 mRNA 처리를 분석합니다.
세포내로 형질감염된 DNA 리포터 구조에서 유래된 mRNA의 분석은 원형 RNA에 적용될 수 있는 대체 사전 mRNA 접합을 연구하는 잘 확립된 방법이다. 일반적으로, 대안 엑손, 그 주변 인트론 및 구성 엑손은 진핵 발현 벡터로 증폭되고 복제된다. 인트론은 종종 단축됩니다. 구성은 진핵 세포로 형질 감염되고 일반적으로 RT-PCR13,14에의해 분석됩니다. 이 접근법은 공동 형질전환 실험13,15,16,17,18에서규제 스플라이스 사이트 및 트랜스 행동 요인을 매핑하는 데 광범위하게 사용되어 왔다. 또한, 단백질 발현 미니유전자의 생성은 대체 스플리팅19,20을변화시키는 물질의 스크리닝을 허용한다.

이 방법은 원형 RNA에 적용되었습니다. 현재, 적어도 12개의 미니진 백본이 문헌에 기재되어 있으며 표 1에요약되어 있다. tRNA 기반 발현시스템(21,22)을제외하고, 이들은 모두 폴리머라제 II 프로모터에 의존한다. 여기서, 우리는 순환 RNA의 생성에 관여하는 시스 및 트랜스 연기 인자를 결정하기 위해 인간 리포터 미니유전자를 생성하는 방법을 설명한다. 게시된 리포터유전자(23)의 서열을 사용하는 방법의 개요는 도 1에도시되어 있다.

Protocol

1. 구문 설계 UCSC 게놈 브라우저24를 사용하여 원형 RNA 형성에 필요한 반복적 요소를 식별하고 이를 구성에 통합합니다. 중요한 것은, 증폭을 위한 프라이머는 반복적인 요소 외부에 있어야 합니다. 원형 RNA 서열(보충도1은 시험 서열)을 https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start 넣고 올바른 ?…

Representative Results

리포터 유전자는 원형 RNA 형성에 영향을 미치는 규제 요인의 결정을 허용합니다. 그러나, 이 리포터 유전자는 크고 수시로 DNA 구조물을 불안정하게 하는 반복적인 요소를 포함합니다. 큰 크기로 인해 종종 엑손과 작은 측면 내향성 부품을 포함하는 게놈 조각을 증폭시킴으로써 달성되는 인트론의 일부를 삭제해야합니다. 이 DNA 조각은 효소로 조립되어 제한 효소없이 시공할 수 있습니다. <p clas…

Discussion

일반적으로 원형 RNA는 낮은 풍부한1이며,이는 그들의 기능과 형성에 대한 연구를 복잡하게합니다. 선형 RNA13과유사하게, 리포터 미니유전자의 사용은 원형 RNA의 형성을 통제하는 시스 및 트랜스 행동 인자의 식별을 허용합니다. 따라서, 이 접근은 내인성 유전자를 사용하여 추가로 시험될 수 있는 가설을 생성합니다.

가장 중요한 단계는 리…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 국방부 국방부 보조금 AZ180075에 의해 지원되었다. 스테판 스엠 감사 재클린 누난 엔다우먼트. 안나 PawluchinD에 의해 지원되었다, 독일의 학술 교류 프로그램, 저스틴 R. 웰던 켄터키 맥스 Steckler 상 대학의 수상자였다.

Materials

(PEI) Hydrochloride Polysciences 24765-1
Builder tool NEB https://nebuilder.neb.com/#!/
Dark Reader Transilluminator. Clare Chemical Research
Enzymatic DNA assembly kit NEB E2621S
Gel and PCR cleanup kit Promega A9282
Glyco Blue Thermo Fisher AM9516
pcDNA3.1 cloning site Polycloning site https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_1_man.pdf
Polymerase 1 NEB M0491L Q5 DNA polymerase
Polymerase 2 Biorad 1725310 Long range polymerase (NEB), iproof (BioRad)
Polymerase 2 Qiagen 206402 Qiagen long range polymerase kit
Reverse Transcriptase Thermo Fisher 18080044
RNA isolation kit Life Technologies 12183025 Ambion by Life Technologies
RNAse R Lucigen RNR07250 Epicenter/Lucigen
Stable competent cells NEB C3040H NEB stable cells
Standard cloning bacteria NEB C2988J NEB5-alpha competent
Web tool to design primers NEB https://nebuilder.neb.com/#!/
Web-based temperature calculations NEB https://tmcalculator.neb.com/#!/main
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References

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Keywords: Circular RNAAlternative SplicingGenomic Expression SystemAlu ElementPCR OptimizationUCSC Genome BrowserRepetitive ElementsPrimer DesignExon-intron BordersReverse Complement
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Welden, J. R., Pawluchin, A., van Doorn, J., Stamm, S. Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs. J. Vis. Exp. (157), e59760, doi:10.3791/59760 (2020).
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