マウスの血液からの血小板の浄化
Summary
ここでは、抗凝固剤の存在下でマウス血液を採取した。血小板は、低速遠心分離を用いてイオヘキソール勾配培地によって精製した。血小板は、実行可能であるかどうかを調査するためにトロンビンで活性化された.精製された血小板の質を、フローサイトメトリーおよび顕微鏡検査によって分析した。
Abstract
血小板は、赤血球 (RBC)、白血球 (WBC)、および血漿タンパク質から自由でなければならない彼らの機能特性を、研究するために全血から精製されます。ここでは、血液サンプル量に対して3倍以上のイオヘキソール勾配培地を用いてマウス血液からの血小板の精製と、20° c で20分間 400 x gの揺動バケットローターでの遠心分離について述べる。精製された血小板の回収/収率は 18.2 ~ 38.5% であり、精製された血小板は安静状態であり、膨大な数の RBC および WBC が含まれていなかった。トロンビンで処理された精製血小板は、93% の活性化を示し、その生存率を示した。我々は、精製血小板が流動サイトメトリーと顕微鏡評価を用いて十分に純粋であることを確認した。これらの血小板は、遺伝子発現、活性化、顆粒放出、凝集、および接着アッセイに使用することができます。この方法は、同様に他の種の血液からの血小板の精製に使用することができます.
Introduction
血小板は、血管の損傷に反応して血液凝固の開始剤として機能する血液の成分である。彼らは血管壁1をふさぐために傷害の部位に集まる。血小板は、トロンボポエチンの影響下で骨髄の巨核球に由来する細胞質の anucleate の断片であり、循環2に入ります。それらは、血小板拡散、凝集、および止血プラグ形成1,3をもたらす細胞内シグナル伝達カスケードを活性化することによって、細胞外環境を感知することができる代謝的活性および検出可能であると考えられる。止血/血栓および創傷治癒4のほかに、血小板は宿主の炎症反応、血管新生、および転移3、5、6、7において重要な役割を果たし、8.
血小板は、血液から精製され、その生化学的および生理的性質を研究するために、他の血液成分から遊離されるべきである。赤血球 (RBC) および白血球 (白血球) が血小板9,10よりもかなり多くの RNA およびタンパク質を含むので、これらの細胞の数が少ないとしても、RNA のトランスクリプトームデータおよびプロテオーム解析を妨げる可能性があるおよび血小板由来のタンパク質があげられる。我々は、GPIIb/IIIa (JON/A) および抗 P-セレクチンのような、全血小板よりも効率的に、トロンビンで活性化される精製された血小板が、抗——のように結合した抗体を見つけた。
血小板は脆弱であるため、サンプルをできるだけ軽度に処理することが重要です。血小板が活性化されれば、それらは顆粒の内容物を放出し、最終的には分解する。したがって、血小板の機能的性質をそのまま維持するためには、単離時に血小板静止を維持することが重要である。いくつかのプロトコールは、ヒト、イヌ、ラット、および非ヒト霊長類からの血小板の分離を種々の方法1、10、11、12によって説明している。いくつかの方法は、遠心分離による多血小板血漿の収集、セパレーションカラムによる濾過、磁気ビーズに結合した RBC および WBC 特異的抗体を用いた血小板の陰性選択などの複数のステップを必要とする。時間がかかり、血小板とその内容が低下することがあります。
フォードと彼の同僚は、イオヘキソール培地11を用いてヒト血液から血小板精製を説明した。この方法は、精製中の血液サンプルおよび培地の同様の体積を使用する。ヒトはより多量の血液を産出するので、比較的簡単に血小板を浄化することができる。
イオヘキソールは、水に自由に可溶性であり、核酸、タンパク質、多糖類、および nucleoproteins13,14の分別に使用される普遍的な密度勾配不活性培地である。それは低オスモル濃度を有し、非毒性であり、したがって、無傷の生きた細胞11の精製のための理想的な媒体となっている。それは非微粒子媒体である;したがって、勾配内の細胞の分布は、血球計数器、フローサイトメーター、または分光光度計を使用して決定することができる。それは、希釈後の細胞または細胞片の酵素または化学反応の大部分を妨げるものではない。
マウスは多くの人間の病気15、16、17、18のための重要な動物モデルとして役立つ。マウスの血小板19,20の浄化を説明するいくつかの公開された記事があります。しかし、マウスは比較的少量の血液を生成するため、血小板の浄化が困難になります。同じ少量の勾配培地および血液サンプルが使用される場合、血小板層は、遠心分離後に RBC − WBC 層から明確に分離することができない。本稿では、血液サンプル量と低速遠心分離に対して3倍以上のイオヘキソール勾配培地を用いたマウス血小板精製の迅速かつ簡便な方法について説明した。我々はまた、トロンビンで精製された血小板を活性化し、フローサイトメトリーおよび顕微鏡検査でその品質を調べた。
Protocol
Representative Results
Discussion
一般的に、血小板は、大量の血液細胞、細胞破片、および生化学的および生理的なアッセイおよびニーズを妨げる可能性のある血漿タンパク質を含む、血小板が豊富な血漿を生成する低速遠心分離によって単離されるさらに精製21.したがって、主要な汚染物質なしに純粋な血小板を生成することができる迅速かつ簡便な方法を使用することが重要です。ここで提示されるプ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、シンシナティ児童研究財団のスタートアップ資金と、シンシナティ大学のパイロット・トランスレーショナル・ M.N. への助成金によって支えられました。シンシナティ児童病院のサービスのフローサイトメトリーコアに感謝したいと思います。
Materials
| APC rat anti-mouse/human CD62P (P-selectin) | Thermoscientific | 17-0626-82 | Platelets activation marker |
| Eppendorf tube | Fisher Scientific | 14-222-166 | Tube for centifuge |
| FACS DIVA software | BD Biosciences | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| FACS tube | Fisher Scientific | 352008 | Tubes for flow cytomtery |
| Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 26140079 | Ingredient for staining buffer |
| FITC rat anti-mouse CD41 | BD Biosciences | 553848 | Platelets marker |
| Flow cytometer | BD Biosciences | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| FlowJo software | FlowJo, Inc. | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP) | EMD Millipore | 03-34-0001 | Prevent platelet clot formation |
| Hematocrit Capillary tube | Fisher Scientific | 22-362566 | Blood collection capillary tube |
| Hemavet | Drew Scientific | Non-catalog item | Blood cell analyzer |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | Cell counting chamber |
| Isoflurane | Baxter | 1001936040 | Use to Anesthetize mouse |
| Microscope (Olympus CKX41) | Olympus | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Nycodenz (Histodenz) | Sigma-Aldrich | D2158 | Gradient medium |
| PE rat anti-mouse CD45 | BD Biosciences | 561087 | WBC marker |
| PE-Cy7 rat anti-mouse TER 119 | BD Biosciences | 557853 | RBC marker |
| Pipet tips 200 µL, wide-bore | ThermoFisher Scientific | 21-236-1A | Transferring blood and platelet samples |
| Pipet tips 1000 µL, wide-bore | ThermoFisher Scientific | 21-236-2C | Transferring blood and platelet samples |
| Phosphate buffured saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14040-117 | Buffer for washing and dilution |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | Physiological saline |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | 02-688-26 | Anti-coagulant |
| Staining buffer | In-house | Non-catalog item | Wash and dilution buffer |
| Steile water | In-house | Non-catalog item | Solvent |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | Swinging bucket rotor centrifuge |
| Thrombin | Enzyme Research Laboratoty | HT 1002a | Platelet activation agonist |
| Tricine | Sigma-Aldrich | T0377 | Buffer for Nycodenz medium |
References
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