인간 다능성 줄기 세포 (hPSCs)에서 분화 된 세포 유형을 생성하는 것은 훌륭한 치료 약속을 보유하고 있지만 여전히 도전적입니다. PSC는 종종 적절한 신호 세트로 자극된 경우에도 차별화할 수 없는 고유한 무능력을 나타냅니다. 여기에 설명된 간단한 도구는 다양한 PSC 라인에서 다중 라인 차별화를 향상시키는 간단한 도구입니다.
다능성 줄기 세포 (PSCs)의 증가 사용에도 불구하고, 다양한 계보에 걸쳐 배아 및 유도 만능 줄기 세포 (ESCs 및 iPSCs)를 효율적으로 분화시키는 도전이 남아 있습니다. 수많은 분화 프로토콜이 개발되었지만 세포주 전반에 걸친 가변성과 분화율이 낮기 때문에 이러한 프로토콜을 성공적으로 구현하는 데 어려움을 겪습니다. 여기서 설명한 것은 PSC의 분화 능력을 향상시키기 위한 쉽고 저렴한 수단이다. 이전에는 디메틸 설폭사이드(DMSO)의 낮은 농도를 가진 줄기 세포를 치료하면 지시된 분화에 따라 상이한 세포 유형으로 분화하는 다양한 PSCs의 성향이 현저히 증가하는 것으로 나타났다. 이 기술은 지금 다른 종에 걸쳐 효과적인 것으로 나타났습니다 (예를 들어, 마우스, 영장류, 그리고 인간) 여러 계보로, 신경 및 피질 구형에서 평활근 세포와 간세포에 이르기까지. DMSO 전처리는 세포 주기를 조절하고 줄기 세포를 차별화 신호에 보다 민감하게 반응하도록 프라이밍하여 PSC 분화를 향상시킵니다. 여기에 제공된 이 간단한 도구를 재현 가능하고 널리 적용할 수 있는 수단으로 사용하여 PSC를 선택한 모든 계보와 보다 효율적으로 차별화하는 방법에 대한 자세한 방법론이 제공됩니다.
다능성 줄기 세포의 사용은 재생 의학 및 줄기 세포 기반 치료, 질병 모델링 및 약물 스크리닝의 분야를 포함하여 생물 의학 연구에서 수많은 발전을 이끌었습니다. 그것은 또한 더 번역 가능한 연구 및 개인화 한 의학의 전반적인 전망으로 이끌어 냈습니다. 20 년 전 유도 만능 줄기 세포 (iPSC) 기술의 출현은 연구원이 체세포조직에서 다능성 줄기 세포를 개발하고 기능성 세포 유형으로 분화하여 다양한 병리를 연구할 수 있게 했습니다. 심혈관, 신경학상 및 면역 학적 질환. 줄기 세포 분화 기술에서 중요한 진전이 있었지만, 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)와 iPSCs를 효과적으로 분화시키는 과제는 여전히 지속되어 줄기 세포 기술의 광범위한 사용을 제한합니다. 연구 프로그램을 제공합니다. 상이한 세포주 및 클론에 대한 고유의 가변성은 줄기 세포주를원하는 보리 1로 분화시키는 데 걸림돌이 되고 있습니다. 또한 hPSC에서 성숙하고 말단으로 분화된 기능성 세포를 도출하는 것은 많은 계보에 걸쳐 지루하고 비효율적인 과정으로 남아 있습니다. 사실, hPSCs에서 분화된 세포는 종종 기능적세포 2로 말단으로 분화하지 못합니다. 환자에서 사용하는 줄기 세포 기반 치료법을 이동시키는 데있어, hPSCs에서 생성되는 세포의 효능을 개선하고 보장할 필요가 있다.
우리의 실험실은 iPSCs와 ESC를 성숙한 세포 유형으로 차별화하는 효율성을 크게 향상시키기 위해 빠르고 저렴한 도구를 설립했습니다. 우리는 일반적으로 사용되는 시약 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 이용한 hiPSCs 및 hESCs의 전처리가 지시된 분화 이전에 24 시간 에서 48시간 동안 줄기 세포 분화 능력의 현저한 개선을 초래한다는 것을 발견하였다. DMSO를 이의로 한 치료는 세포 주기의 초기 G1 단계에서 hiPSCs 및 hESCs의 비율을 증가시키고 망막모세포종 단백질(Rb)3,세포 증식, 생존 및 분화의 중요한 조절제인4를활성화시킨다. 최근 작업에서 Rb와 그 가족 구성원이 DMSO의 비례 화 효과에 필요한 것으로 나타났습니다. DMSO의 효과5. 배아 발달 동안세포주기와 유사하게, ESCs 및 iPSCs의 세포 주기는 자가 재생을 촉진하는 축약된 G1 상을 특징으로 하며,7,8. 이 축약된 G1 단계는 더 무제한 확산을 허용하지만분화 4,9. G1에서 성장 체포를 촉진하고 hESCs 및 iPSCs의 세포 주기에서 체크포인트 제어를 활성화함으로써, DMSO 치료는 지시된 분화에 따른 세포 운명 변화에 대한 세포를 소수로 한다.
현재까지, DMSO 전처리는 30개 이상의 대조군 및 질병 특이적 인간 ESC 및 iPSC 세포주3,5뿐만 아니라 줄기세포 및 기타의 분화에서 3개의 배아층 모두에 대한 분화 능력을 향상시키는 것으로 나타났다. 후속 연구에서 다른 성숙한 세포 유형의 다양한 세포주10,11,12,13,14,15,16, 17세 , 18세 , 19세 , 20개 , 21세 , 22세 , 23세 , 24세 , 25개 , 26세 , 27세 , 28 (표1). 더욱이, DMSO 치료는 비인간 1차세포(21,23)의 분화를 향상시키는 데 효과적인 것으로 나타났다(예를 들어, 마우스, 영장류, 토끼), 종에 걸쳐 공유 된 메커니즘을 제안. 마지막으로, DMSO 전처리는 또한 유전자 편집 기술로 확장되었습니다, hESCs /iPSCs의 24 시간 DMSO 전처리가 크게 클러스터 된 정기적으로 간격 짧은 Palindromic 반복의 능력을 증가 것을 보여주는 한 특정 연구와 (CRISPR) /CRISPR-관련 단백질-9(Cas9)-의도하지 않은 돌연변이를 통합하지 않고 비코딩DNA의 편집 효율(29). 여기에 제공된 줄기 세포 생물학 및 지시된 분화에 있는 응용을 위한 hESCs 및 iPSCs의 DMSO 전처리의 상세한 방법론이다.
요약하면, 이 프로토콜은 모든 1차 생식층, 다양한 유형의 전문 전구 세포, 심지어 기능적이고 성숙한 세포 유형인 시험관 내 다능성 줄기 세포(PSC)의 분화 능력을 향상시키는 간단하고 저렴한 도구를 설명합니다. 및 생체 내 설정. 그림형은 당사의 실험실뿐만 아니라 다른 실험실에서 효과적으로 재현된 특정 분화 프로토콜이지만, 선택의 임의의 분화 프로토콜은 DMSO 처리 후 사용될 수 있다. 표1에 나타낸 바와 같이, 다수의 실험실은 또한 다양한 다른 말단 세포 유형을 생성하기 위해 상이한 패러다임을 이용한 과도 DMSO 처리 후 PSC 분화의 향상을 입증했다. 더욱이, 여기서 의 방법은 인간 PSCs의 사용을 기술하지만, DMSO 전처리는 종에 걸쳐 이용될 수 있고 마우스, 토끼 및 영장류 PSCs에 효과적인 것으로 나타났다.
DMSO의 더 높은 복용량은 세포 독성 것으로 알려져 있지만, 이 방법에 사용되는 낮은 복용량 (1%-2%) 일시적인 기간 동안 최소한의 세포 사멸을 초래합니다. DMSO 처리 직후 전체 세포 수는 세포 주기의 G1 단계에서 세포 주기 체포의 DMSO 승진으로 인해 감소할 수 있는 반면, 이전 연구는 세포가 제거 후 대조군 배양물과 동일한 수준의 합류에 도달할 수 있음을 보여줍니다. DMSO3.
DMSO 전처리의 백분율 및 지속 시간은 세포주당 최적화되어야 합니다. 치료 시간은 세포의 사이클링 / 두 배 시간을 고려하여 조정해야합니다. 예를 들어, 마우스 PSC는 전형적으로 약 15 시간의 훨씬 더 짧은 사이클링 시간을 가지며; 따라서, 이들 세포에 대한 15시간 동안의 DMSO 처리는 충분하다. 일부 실험실은 또한 DMSO 치료가 분화 프로토콜 동안 또는 더 낮은 농도에서 계속될 때 유익하다는 것을 발견하였다(표 1참조). 일부 PSC 라인은 특정 계보에 대한 차별화를 보다 수정할 수 있다는 점에 유의해야 합니다. 예를 들어, HUES6 세포는 분화에 덜 허용되는 것으로 나타났으며, 따라서 DMSO치료로 개선을 표시하였다(도 2). 대안적으로, 도 4 및 도 5에 사용된 HUES8 세포는 내피 분화쪽으로 더 높은 성향을 보이는 것으로 나타났다; 따라서, 최종 내배엽을 향한 초기 단계에서 분화를 위한 제어와 DMSO 사이에 더 적은 차이가 나타났다. 그럼에도 불구하고, DMSO 전처리의 향상은 이러한 세포주에서의 분화의 후기 단계에서 관찰된다(도4B). DMSO 처리는 또한 2D 및 3D 세포 배양 시스템 모두에서 효과적이며, 세포 배양 판에 다양한 유형의 코팅 물질과 함께 사용할 수 있으며, 성장과 확장을 촉진하는 다양한 유형의 유지 보수 매체에서 작동한다는 점에서 다재다능합니다. hPSCs(예: mTeSR, E8, MEF 컨디셔닝 미디어 등)
보다 일반적으로, 이러한 결과는 다능성 줄기 세포의 시작 상태가 기능성 세포 유형으로의 말단 분화뿐만 아니라 초기 분화성향에 강한 영향을 미친다는 것을 시사한다. 우리는 이전에 hPSCs3,5에서Rb를 통해 DMSO 처리 기능이 있음을 보여주었습니다. Rb는 세포의 말단 분화, 세포 생존 및 유전적 안정성을 촉진하는 데 중요한 역할을하며,따라서세포에 대한 지속적인 효과를 설명할 수 있습니다. DMSO 처리 hPSCs와 차별화됩니다. 규제의 이 초기 모드를 표적으로 하는 것은 분화를 위한 더 나은 궤도에 hPSCs를 두어 궁극적으로 재생 의학을 위한 그들의 유용성을 향상할 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 스탠포드 대학 의과 대학의 보조금과 S. C에 수여 시벨 펠로우십에 의해 지원되었다.
2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate | Corning | 353046 | |
9-Position stir plate | Chemglass | CLS-4100 | |
Accutase | Gibco | 11105-01 | |
Activin A | R&D Systems | 338-AC | |
Advanced RPMI | Gibco | 12633012 | |
Alk5i II | Axxora | ALX-270-445 | |
all-trans retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 | |
anti-Brachyury | R&D Systems | AF2085 | No variablity observed across different lot numbers |
anti-C-peptide | Developmental Studies Hybridoma Bank | GN-ID4 | No variablity observed across different lot numbers |
anti-FoxA2 | Millipore | 07-633 | No variablity observed across different lot numbers |
anti-Nkx2.2 | University of Iowa, Developmental Hybridoma Bank | 74.5A5 | No variablity observed across different lot numbers |
anti-Nkx6.1 | University of Iowa, Developmental Hybridoma Bank; | F55A12-supernatant | No variablity observed across different lot numbers |
anti-Olig2 | EMD Millipore | MABN50 | No variablity observed across different lot numbers |
anti-Pax-6 | Biolegend | 901301 | No variablity observed across different lot numbers |
anti-Pdx1 | R&D Systems | AF2419 | No variablity observed across different lot numbers |
anti-SOX1 | R&D Systems | AF3369 | No variablity observed across different lot numbers |
anti-SOX17 | R&D Systems | AF1924 | No variablity observed across different lot numbers |
B-27 Supplement, minus Vitamin A | Gibco | 12587010 | |
basic fibroblast growth factor | Gibco | PHG0264 | |
Betacellulin | Thermo Fisher Scientific | 50932345 | |
Chir99021 | Stemgent | 04-000-10 | |
CMRL 1066 | Corning | 99-603-CV | |
Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAF1000 | |
D-(+)-Glucose | Sigma | G7528 | |
DAPI | Invitrogen | D1306 | |
Disposable Spinner Flasks | Corning, VWR | 89089-814 | |
DMEM/F-12 | Gibco | 11320033 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
Essential 6 Media | Gibco | A1516501 | |
FAF-BSA | Proliant | 68700 | |
FGF7 | PeproTech | 100-19 | |
Geltrex | Gibco | A1413202 | |
GlutaMAX | Gibco | 35050061 | |
Heparin | Sigma | H3149 | |
Human Ultrasensitive Insulin ELISA | ALPCO Diagnostics | 80-INSHUU-E01.1 | |
ITS-X | Invitrogen | 51500056 | |
KGF | Peprotech | AF-100-19 | |
Knockout DMEM | Gibco | 10829018 | |
KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | |
L-3,3′,5-Triiodothyronine (T3) | EMD Millipore | 642245 | |
LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | |
Matrigel Matrix | Corning | 354277 | |
MCDB-131 | Cellgro | 15-100-CV | |
MEM NEAA | Gibco | 11140050 | |
mTeSR 1 | StemCell Technologies | 5850 | |
N2 Supplement | Life Technologies | 17502048 | |
NaHCO3 | Sigma | S3817 | |
Noggin Fc Chimera Protein | R&D Systems | 3344-NG-050 | |
PdBU | EMD Millipore | 524390 | |
Penicillin/Streptomycin | Mediatech | 30-002-CI | |
RPMI | Gibco | 11875-093 | |
Sant1 | Sigma-Aldrich | S4572 | |
SB431542 | Stemgent | 04-0010 | |
Smoothened Agonist, SAG | EMD Millipore | 566660 | |
StemPro Accutase | Gibco | A1110501 | |
TrypLE | Gibco | 12604013 | |
Ultra-Low Attachment Microplates | Corning | 3471 | |
Vitamin C | Sigma-Aldrich | A4544 | |
Wnt3a | R&D Systems | 5036-WN | |
XAV 939 | Tocris | 3748 | |
XXI | EMD Millipore | 565790 | |
Y-27632 | StemCell Technologies | 72302 |