मानव कॉर्ड रक्त व्युत्पन्न CD34+ Hematopoietic स्टेम और जनक कोशिकाओं के पैन-माइलॉयड भेदभाव
Summary
यहाँ, हम इम्यूनोफेनोटाइपिक लक्षण और साइटोकिन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत कॉर्ड रक्त व्युत्पन्न CD34+ hematopoietic स्टेम और चार माइलॉयड वंश के लिए संतति कोशिकाओं के भेदभाव प्रेरित. इस प्रोटोकॉल के अनुप्रयोगों में माइलॉयड रोग उत्परिवर्तनों या CD34+ कोशिकाओं के माइलॉयड भेदभाव पर छोटे अणुओं के प्रभाव पर जांच शामिल है।
Abstract
मानव हीमाटोपोइटिक स्टेम सेल के पूर्व विवो विभेदन हेमेटोपोइसिस के अध्ययन के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया मॉडल है। यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल CD34 के cytokine प्रेरित भेदभाव के लिए है+ hematopoietic स्टेम और चार माइलॉयड वंश कोशिकाओं के लिए जनक कोशिकाओं. CD34+ कोशिकाओं मानव गर्भनाल रक्त से अलग कर रहे हैं और cytokines की उपस्थिति में एमएस-5 स्ट्रॉमल कोशिकाओं के साथ सह-संस्कृत. स्टेम और संतति कोशिकाओं के इम्यूनोफेनोटाइपिक लक्षण, और विभेदित माइलॉयड वंश कोशिकाओं का वर्णन किया गया है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना, CD34+ कोशिकाओं छोटे अणुओं के साथ incubated किया जा सकता है या lentiviruses के साथ transduced माइलॉयड रोग उत्परिवर्तनों व्यक्त करने के लिए माइलॉयड भेदभाव पर उनके प्रभाव की जांच.
Introduction
हेमेटोपोएटिक स्टेम सेल (एचएससी) का सामान्य भेदभाव सभी रक्त कोशिका वंशों के शारीरिक स्तर के रखरखाव के लिए महत्वपूर्ण है। भेदभाव के दौरान, विकास कारकों और साइटोकिन्स सहित extracellular संकेतों के लिए एक समन्वित प्रतिक्रिया में, HSCs पहले बहुशक्तिशाली जनक(एमपीपी) कोशिकाओं है कि लिम्फो माइलॉयड क्षमता 1,2,3 को जन्म देते हैं ,4 (चित्र 1)। एमपीपी सामान्य माइलॉयड संततिकार (सीएमपी) और आम लिम्फोइड संतति (सीएलपी) को जन्म देते हैं जो वंश-प्रतिबंधित हैं। सीएलपी बी, टी, और प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं के शामिल लसीकाभ वंश में अंतर। सीएमपी दो और प्रतिबंधित संतति आबादी, मेगाकैरियोसाइट एरिथ्रोइड संतति (एमईपी), और ग्रैन्युलोसाइट मोनोसाइट संतति (जीएमपी) के माध्यम से माइलॉयड वंश उत्पन्न करते हैं। एमईपी मेगाकैरियोसाइट्स और एरिथ्रोसाइट्स को जन्म देता है, जबकि जीजीपी ग्रैन्युलोसाइट्स और मोनोसाइट्स को जन्म देते हैं। सीएमपी के माध्यम से उत्पन्न होने के अलावा, मेगाकारियोसाइट्स को एचएससी या पूर्व एमपीपी से गैर-कैनोनिकल पथ5,6 के माध्यम से सीधे उत्पन्न होने की सूचना मिलीहै।
हेमाटोपोएटिक स्टेम और संतति कोशिकाओं (HSPCs) सतह मार्कर CD34 और वंश विशिष्ट मार्करों की कमी (लिन–) की विशेषता है. अन्य सतह मार्कर ों कि आमतौर पर HSCs और माइलॉयड जनक आबादी भेद करने के लिए कार्यरत हैं CD38, CD45RA, और CD1232 (चित्र 1) शामिल हैं. HSCs और MPPs Lin हैं–/CD34+/CD38– औरLin–/CD34+/ माइलॉयड प्रतिबद्ध जनक आबादी की उपस्थिति या CD45RA और CD123 की अनुपस्थिति द्वारा प्रतिष्ठित हैं. सीएमपी लिनहैं –/CD34+/CD38+/CD45RA–/CD123लो, GMPs लिन हैं–/CD34+/CD38+/CD45RA+/CD123लो, और MEPs Lin–/CD34+ /CD38+/CD45RA–/CD123–|
CD34 की कुल आबादी+ स्टेम और संतति कोशिकाओं मानव गर्भनाल रक्त (UCB), अस्थि मज्जा, और परिधीय रक्त से प्राप्त किया जा सकता है. सीडी34+ कोशिकाओं का गठन 0.02% करने के लिए 1.46% कुल मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (MNCs) में मानव यूसीबी में, जबकि उनके प्रतिशत के बीच बदलता है 0.5% और 5.3% अस्थि मज्जा में और परिधीय रक्त7में $0.01% पर बहुत कम है,8,9 . यूसीबी व्युत्पन्न CD34+ कोशिकाओं की प्रोलइफेटिव क्षमता और भेदभाव क्षमता अस्थि मज्जा या परिधीय रक्त कोशिकाओं की तुलना में काफी अधिक है1,10, जिससे प्राप्त करने के लिए एक विशिष्ट लाभ की पेशकश भेदभाव के दौरान कोशिकाओं के इम्यूनोफेनोटाइपिक और आकृतिक लक्षण के साथ संयोजन में आणविक विश्लेषण के लिए पर्याप्त सामग्री।
गर्भनाल रक्त व्युत्पन्न CD34+ HSPCs के पूर्व vivo भेदभाव सामान्य hematopoiesis और hematopoietic रोग तंत्र की जांच के लिए एक व्यापक रूप से लागू मॉडल है. जब उपयुक्त साइटोकिन्स के साथ सुसंस्कृत, यूसीबी CD34+ HSPCs माइलॉयड या लसीकाभ वंश11,12,13,14,15 के साथ अंतर करने के लिए प्रेरित किया जा सकता है , 16.यहाँ, हम मानव यूसीबी से CD34+ HSPCs के अलगाव और इम्यूनोफेनोटाइपिक लक्षण के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, और माइलॉयड वंश कोशिकाओं के लिए उनके भेदभाव के लिए। यह संस्कृति प्रणाली एमएस-5 स्ट्रॉमल कोशिकाओं की उपस्थिति में अस्थि मज्जा में सूक्ष्म पर्यावरण की नकल करने के लिए साइटोकिन-प्रेरित भेदभाव पर आधारित है। संस्कृति की स्थिति CD34+ कोशिकाओं के एक प्रारंभिक विस्तार का कारण, कोशिकाओं है कि चार माइलॉयड वंश कोशिकाओं के लिए मार्करों व्यक्त करने के लिए उनके भेदभाव के बाद, अर्थात् granulocytes (CD66b), monocytes (CD14), megakarycytes (CD41), और एरिथ्रोसाइट्स (CD235a)। CD34 केअनुप्रयोगों + सेल भेदभाव प्रोटोकॉल hematopoiesis को विनियमित आणविक तंत्र पर अध्ययन शामिल हैं, और माइलॉयड रोग के प्रभाव की जांच जुड़े उत्परिवर्तनों और आत्म नवीकरण पर छोटे अणुओं और HSPCs के भेदभाव.
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल UCB व्युत्पन्न CD34+ HSPCs के चार माइलॉयड वंश ों के पूर्व vivo भेदभाव के लिए उपयुक्त है. एससीएफ, टीपीओ, Flt3L और IL3 से मिलकर एक साइटोकिन मिश्रण के साथ प्रारंभिक ऊष्मायन CD34+ कोशिकाओं को उत्त?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों को वेंडी बैरेट, राहेल Caballero, और Maricopa एकीकृत स्वास्थ्य प्रणालियों के गैब्रिएला Ruiz de-पहचान और दान कॉर्ड रक्त इकाइयों के लिए शुक्रिया अदा करना चाहते हैं, Mrinalini काला प्रवाह साइटोमेट्री के साथ सहायता के लिए, और समलैंगिक बदमाश और क्रिस्टोफर Seet के लिए पूर्व vivo माइलॉयड भेदभाव पर सलाह. यह काम स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों (R21CA170786 और R01GM127464) और अमेरिकन कैंसर सोसायटी (संस्थागत अनुसंधान अनुदान 74-001-34-IRG) से एस एस के लिए धन द्वारा समर्थित किया गया था. सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करता है.
Materials
| 0.4% Trypan blue solution | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | Dilute working stock to 0.2% in sterile 1x PBS |
| 0.5 M UltraPure Ethylene diamine tetra acetic acid, pH 8.0 | Gibco | 15575-038 | |
| 10x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen | 14185052 | Dilute to 1x with sterile distilled water & pH to 7.2 |
| 2.5% Trypsin, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15090046 | Dilute working stock to 1x with sterile 1x PBS |
| 30 µm Pre-separation filters | Miltenyi biotech | 130-041-407 | |
| 35% sterile Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7979 | |
| 7-AAD | Biolegend | 420404 | Used as a live/dead stain to eliminate dead cells from FACS analysis |
| Anti-human CD10-FITC antibody (Clone HI10a) | Biolegend | 312207 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD11b-FITC (activated) antibody (Clone CBRM1/5) | Biolegend | 301403 | Use 1:5 dilution |
| Anti-human CD123-APC antibody (Clone 6H6) | Biolegend | 306012 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD14-PE antibody (Clone M5E2) | Biolegend | 301806 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD19-FITC antibody (Clone 4G7) | BD Biosciences | 347543 | Use 1:5 dilution |
| Anti-human CD235a-APC antibody (Clone GA-R2 (HIR2)) | BD Biosciences | 551336 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD235a-FITC antibody (Clone HIR2) | Biolegend | 306609 | Use 1:50 dilution |
| Anti-human CD34-APC-Cy7 antibody (Clone 581) | Biolegend | 343514 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD38-PE antibody (Clone HIT2) | Biolegend | 303506 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD3-FITC antibody (Clone UCHT1) | Biolegend | 300405 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD41a-PerCP-Cy5.5 antibody (Clone HIP8) | Biolegend | 303720 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD45Ra-PE-Cy7 antibody (Clone HI100) | Biolegend | 304126 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD66b-PE-Cy7 antibody (Clone G10F5) | Biolegend | 305116 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD7-FITC antibody (Clone CD7-6B7) | Biolegend | 343103 | Use 1:20 dilution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | Filter sterilize before use |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) powder with L-Glutamine | Gibco | 12100046 | Reconstitute 1 packet to make 1 L of DMEM media with sodium bicarbonate, 10% FBS & 1% penicillin & streptomycin |
| Fetal bovine serum, Australian source, heat inactivated | Omega Scientific | FB-22 Lot #609716 | |
| Human CD34 microbead kit | Miltenyi biotech | 130-046-702 | |
| Human Thrombopoietin (TPO), research grade | Miltenyi biotech | 130-094-011 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 50 ng/mL for both myeloid differentiation & stimulation medium |
| L-Glutamine | Omega Scientific | GS-60 | 2 mM concentration in stimulation medium |
| LS Columns | Miltenyi biotech | 130-042-401 | |
| MACS Multi stand | Miltenyi biotech | 130-042-303 | |
| MidiMACS magnetic separator | Miltenyi biotech | 130-042-302 | |
| MNC fractionation media (Ficol-Paque PLUS) | GE Healthcare Biosciences | 17-1440-03 | |
| MS-5 cells | Gift from the laboratory of Gay Crooks, UCLA | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Heat 800 mL of 1x PBS in a glass beaker on a stir plate in a chemical hood to ~65 °C. Add 10 g of paraformaldehyde powder. To completely dissolve the paraformaldehyde, raise the pH by adding 1 N NaOH. Cool and filter the solution and make up the volume to 1 L with 1x PBS. Adjust the pH to 7.2. |
| Penicillin & Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458-100ml | |
| Poly-L lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | Make a 10 mg/mL stock in 1x PBS |
| Recombinant human erythropoietin-alpha (rHu EPO-α) | BioBasic | RC213-15 | Make a stock of 2000 units/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 4 units/mL for myeloid differentiation |
| Recombinant human fibronectin fragment (RetroNectin) | Takara | T100B | Use 20 µg/mL diluted in sterile 1x PBS to coat wells prior to stimulation of CD34+ HSCs. |
| Recombinant human Flt-3 ligand (rHu Flt-3L) | BioBasic | RC214-16 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 50 ng/mL in stimulation medium |
| Recombinant human interleukin-3 (rHu IL-3) | BioBasic | RC212-14 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 20 ng/mL in stimulation medium |
| Recombinant human stem cell factor (rHu SCF) | BioBasic | RC213-12 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 50 ng/mL in stimulation medium |
| Serum free medium (X-Vivo-15) | Lonza | 04-418Q | |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Wright-Giemsa stain, modified | Sigma-Aldrich | WG16-500 | Use according to manufacturer's instructions |
| Equipment | |||
| BD LSR II flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Centrifuge | Sorvall Legend RT | ||
| Light microscope | Olympus |
References
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