Summary

Diferenciação Pan-Myeloid do sangue humano do cabo derivado CD34+ da haste hematopoietic e das pilhas do progenitor

Published: August 09, 2019
doi:

Summary

Aqui, nós apresentamos um protocolo para a caracterização immunophenotypic e a diferenciação induzida citocinas do sangue do cabo derivado CD34+ a haste hematopoietic e as pilhas do progenitor às quatro linhagens Myeloid. As aplicações deste protocolo incluem investigações sobre o efeito de mutações da doença Myeloid ou de moléculas pequenas na diferenciação Myeloid das pilhas de CD34+ .

Abstract

A diferenciação ex vivo de células-tronco hematopoiéticas humanas é um modelo amplamente utilizado para estudar a hematopoiese. O protocolo descrito aqui é para a diferenciação induzida citocinas de pilhas da haste e do progenitor de CD34+ hematopoietic às quatro pilhas myeloid da linhagem. As pilhas de CD34+ são isoladas do sangue humano do cabo de cordão umbilical e co-cultivadas com as pilhas STROMAL MS-5 na presença de cytokines. A caracterização de immunophenotypic das pilhas da haste e do progenitor, e as pilhas Myeloid diferenciadas da linhagem são descritas. Usando este protocolo, as pilhas de CD34+ podem ser incubadas com moléculas pequenas ou transadas com lentivirus para expressar mutações myeloid da doença para investigar seu impacto na diferenciação Myeloid.

Introduction

A diferenciação normal de células-tronco hematopoiéticas (HSCs) é fundamental para a manutenção de níveis fisiológicos de todas as linhagens de células sanguíneas. Durante a diferenciação, em uma resposta coordenada às pistas extracelulares, incluindo fatores de crescimento e citocinas, as hscs primeiro dão origem a células de progenitoras multipotentes (MPP) que têm potencial lympho-mielóide1,2,3 ,4 (Figura 1). Os MPPs dão origem a progenitores mielóides comuns (CMPs) e progenitores linfoides comuns (CLPs) que são restritos à linhagem. Os CLPs diferenciam nas linhagens lymphoid compostas de B, T, e de pilhas naturais do assassino. Os CMPS geram as linhagens Myeloid através de duas populações mais restritas do progenitor, dos progenitores Erythroid do megacariócito (deputados), e dos progenitores do monocyte do granulocyte (GMPs). Os eurodeputados dão origem a megacariócitos e eritrócitos, enquanto os GMPs dão origem a granulócitos e monócitos. Além do que levanta-se com CMPS, os megacariócitos foram relatados para levantar-se também diretamente de hscs ou de Mpps adiantados através das vias não-canônicas5,6.

As células tronco e progenitoras hematopoiéticas (HSPCs) são caracterizadas pelo marcador de superfície CD34 e pela falta de marcadores específicos de linhagem (Lin). Outros marcadores de superfície comumente empregados para distinguir HSCs e populações de progenitoras mielóides incluem CD38, CD45RA e CD1232 (Figura 1). HSCs e MPPs são Lin/Cd34+/CD38 e Lin/CD34+/CD38+, respectivamente. As populações de progenitoras comprometidas mielóides distinguem-se pela presença ou ausência de CD45RA e CD123. As CMPS são Lin/CD34+/CD38+/CD45RA/CD123lo, os GMPs são Lin/CD34+/CD38+/CD45RA+/CD123lo, e os eurodeputados são Lin/CD34+ /Cd38+/Cd45ra/CD123.

A população total de células CD34+ Stem e progenitoras pode ser obtida a partir do sangue do cordão umbilical humano (UCB), da medula óssea e do sangue periférico. As células CD34+ constituem 0, 2% a 1,46% das células mononucleares totais (MNCs) em UCB humano, enquanto a sua percentagem varia entre 0,5% e 5,3% na medula óssea e é muito mais baixa em ~ 0, 1% no sangue periférico7,8,9 . A capacidade proliferativa e o potencial de diferenciação das células CD34+ derivadas de UCB é significativamente maior do que a da medula óssea ou das células sanguíneas periféricas1,10, oferecendo assim uma vantagem distinta para obter material suficiente para análises moleculares em combinação com a realização de caracterização imunofenootípica e morfológica das células durante a diferenciação.

A diferenciação ex vivo do sangue do cordão umbilical CD34+ hspcs é um modelo amplamente aplicado para a investigação de hematopoiese normal e mecanismos de doença hematopoética. Quando cultivadas com as citocinas apropriadas, a UCB CD34+ hspcs pode ser induzida para diferenciar ao longo das linhagens mielóide ou linfoide11,12,13,14,15 , 16. aqui, nós descrevemos protocolos para a isolação e a caracterização immunophenotypic do CD34+ HSPCS do UCB humano, e para sua diferenciação às pilhas myeloid da linhagem. Este sistema da cultura é baseado na diferenciação cytokine-induzida dos HSPCs na presença de pilhas stromal MS-5 para imitar o microambiente na medula. As condições da cultura causam uma expansão inicial das pilhas de CD34+ , seguidas por sua diferenciação às pilhas que expressam marcadores para as quatro pilhas myeloid da linhagem, a saber os granululocytes (CD66b), os monócitos (CD14), os megacariócitos (CD41), e eritrócitos (CD235a). As aplicações do protocolo de diferenciação celular CD34+ incluem estudos sobre mecanismos moleculares que regulam a hematopoiese, e investigações sobre o impacto de mutações associadas à doença mielóide e pequenas moléculas na autorenovação e diferenciação de HSPCs.

Protocol

O sangue do cordão umbilical humano para experimentação foi doado por indivíduos sadios após consentimento informado para a Maricopa sistemas integrados de saúde (MIHS), Phoenix. As unidades desidentificadas foram obtidas por meio de um acordo de transferência de material entre a MIHS e a Universidade do Arizona. 1. reagentes e amortecedores Nota: Prepare todos os reagentes e tampões condições estéreis em um armário de segurança biológic…

Representative Results

A aplicação dos protocolos acima rende 5,6 (± 0,5) x 108 MNCs e 1 (± 0,3) x 106 células CD34+ de uma unidade de sangue do cabo de ~ 100 ml. A percentagem de células CD34+ totais varia entre 80-90% (Figura 2A, B). A análise imunofenotípica pelo esquema descrito por Manz et al.5 demonstra que as células CD34+ tipicamente consistem em ~ 20% hscs e ~ 72% Mpps que são Lin-/Cd34<sup…

Discussion

O protocolo descrito aqui é apropriado para a diferenciação ex vivo de UCB derivado CD34+ hspcs às quatro linhagens Myeloid. A incubação inicial com uma mistura de citocina consistindo de SCF, TPO, Flt3L e IL3 estimula as células CD34+ . Subseqüentemente, a diferenciação é conseguida com um cocktail de SCF, de IL3, de Flt3L, de EPO, e de TPO. Nesta mistura, o SCF, o IL3, e o Flt3L são importantes para a sobrevivência e a proliferação de CD34+ hscs. ePO e TPO promovem a dife…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores gostariam de agradecer a Wendy Barrett, Rachel Caballero, e Gabriella Ruiz de Maricopa sistemas integrados de saúde para as unidades de sangue de cabo de-identificado e doado, Mrinalini Kala para assistência com citometria de fluxo, e bandidos gays e Christopher seet para aconselhamento sobre diferenciação mielóide ex vivo. Este trabalho foi apoiado por fundos para S.S. dos institutos nacionais de saúde (R21CA170786 e R01GM127464) e da sociedade americana de câncer (a pesquisa institucional Grant 74-001-34-IRG). O conteúdo é unicamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente os pontos de vista oficiais dos institutos nacionais de saúde.

Materials

0.4% Trypan blue solution Thermo Fisher Scientific 15250-061 Dilute working stock to 0.2% in sterile 1x PBS
0.5 M UltraPure Ethylene diamine tetra acetic acid, pH 8.0 Gibco  15575-038
10x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) Invitrogen 14185052 Dilute to 1x with sterile distilled water & pH to 7.2
2.5% Trypsin, no phenol red Thermo Fisher Scientific 15090046 Dilute working stock to 1x with sterile 1x PBS
30 µm Pre-separation filters Miltenyi biotech 130-041-407
35% sterile Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A7979
7-AAD Biolegend 420404 Used as a live/dead stain to eliminate dead cells from FACS analysis
Anti-human CD10-FITC antibody (Clone HI10a) Biolegend 312207 Use 1:20 dilution
Anti-human CD11b-FITC (activated) antibody (Clone CBRM1/5) Biolegend 301403 Use 1:5 dilution
Anti-human CD123-APC antibody (Clone 6H6) Biolegend 306012 Use 1:20 dilution
Anti-human CD14-PE antibody (Clone M5E2) Biolegend 301806 Use 1:20 dilution
Anti-human CD19-FITC antibody (Clone 4G7) BD Biosciences 347543 Use 1:5 dilution
Anti-human CD235a-APC antibody (Clone GA-R2 (HIR2)) BD Biosciences 551336 Use 1:20 dilution
Anti-human CD235a-FITC antibody (Clone HIR2) Biolegend 306609 Use 1:50 dilution
Anti-human CD34-APC-Cy7 antibody (Clone 581) Biolegend 343514 Use 1:20 dilution
Anti-human CD38-PE antibody (Clone HIT2) Biolegend 303506 Use 1:20 dilution
Anti-human CD3-FITC antibody (Clone UCHT1) Biolegend 300405 Use 1:20 dilution
Anti-human CD41a-PerCP-Cy5.5 antibody (Clone HIP8) Biolegend 303720 Use 1:20 dilution
Anti-human CD45Ra-PE-Cy7 antibody (Clone HI100) Biolegend 304126 Use 1:20 dilution
Anti-human CD66b-PE-Cy7 antibody (Clone G10F5) Biolegend 305116 Use 1:20 dilution
Anti-human CD7-FITC antibody (Clone CD7-6B7) Biolegend 343103 Use 1:20 dilution
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific BP231-100 Filter sterilize before use
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) powder with L-Glutamine  Gibco 12100046 Reconstitute 1 packet to make 1 L of DMEM media  with sodium bicarbonate, 10% FBS & 1% penicillin & streptomycin 
Fetal bovine serum, Australian source, heat inactivated Omega Scientific FB-22 Lot #609716
Human CD34 microbead kit  Miltenyi biotech 130-046-702
Human Thrombopoietin (TPO), research grade Miltenyi biotech 130-094-011 Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 50 ng/mL for both myeloid differentiation & stimulation medium
L-Glutamine Omega Scientific GS-60 2 mM concentration in stimulation medium
LS Columns Miltenyi biotech 130-042-401
MACS Multi stand Miltenyi biotech 130-042-303
MidiMACS magnetic separator Miltenyi biotech 130-042-302
MNC fractionation media (Ficol-Paque PLUS) GE Healthcare Biosciences 17-1440-03
MS-5 cells Gift from the laboratory of Gay Crooks, UCLA
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 Heat 800 mL of 1x PBS in a glass beaker on a stir plate in a chemical hood to ~65 °C. Add 10 g of paraformaldehyde powder. To completely dissolve the paraformaldehyde, raise the pH by adding 1 N NaOH. Cool and filter the solution and make up the volume to 1 L with 1x PBS. Adjust the pH to 7.2. 
Penicillin & Streptomycin Sigma-Aldrich P4458-100ml
Poly-L lysine Sigma-Aldrich P2636 Make a 10 mg/mL stock in 1x PBS
Recombinant human erythropoietin-alpha (rHu EPO-α) BioBasic RC213-15 Make a stock of 2000 units/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 4 units/mL for myeloid differentiation
Recombinant human fibronectin fragment (RetroNectin) Takara  T100B Use 20 µg/mL diluted in sterile 1x PBS to coat wells prior to stimulation of CD34+ HSCs.
Recombinant human Flt-3 ligand (rHu Flt-3L) BioBasic RC214-16 Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 50 ng/mL in stimulation medium
Recombinant human interleukin-3 (rHu IL-3) BioBasic RC212-14 Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 20 ng/mL in stimulation medium
Recombinant human stem cell factor (rHu SCF) BioBasic RC213-12 Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 50 ng/mL in stimulation medium
Serum free medium (X-Vivo-15) Lonza  04-418Q
Sodium bicarbonate Fisher Scientific BP328-500
Wright-Giemsa stain, modified Sigma-Aldrich WG16-500 Use according to manufacturer's instructions
Equipment 
BD LSR II flow cytometer BD Biosciences
Centrifuge Sorvall Legend RT
Light microscope Olympus

References

  1. Hao, Q. L., Shah, A. J., Thiemann, F. T., Smogorzewska, E. M., Crooks, G. M. A functional comparison of CD34 + CD38- cells in cord blood and bone marrow. Blood. 86 (10), 3745-3753 (1995).
  2. Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11872-11877 (2002).
  3. Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell. 91 (5), 661-672 (1997).
  4. Seita, J., Weissman, I. L. Hematopoietic stem cell: self-renewal versus differentiation. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. 2 (6), 640-653 (2010).
  5. Haas, S., et al. Inflammation-Induced Emergency Megakaryopoiesis Driven by Hematopoietic Stem Cell-like Megakaryocyte Progenitors. Cell Stem Cell. 17 (4), 422-434 (2015).
  6. Sanjuan-Pla, A., et al. Platelet-biased stem cells reside at the apex of the haematopoietic stem-cell hierarchy. Nature. 502 (7470), 232-236 (2013).
  7. Bender, J. G., et al. Phenotypic analysis and characterization of CD34+ cells from normal human bone marrow, cord blood, peripheral blood, and mobilized peripheral blood from patients undergoing autologous stem cell transplantation. Clinical Immunology and Immunopathology. 70 (1), 10-18 (1994).
  8. Fritsch, G., et al. The composition of CD34 subpopulations differs between bone marrow, blood and cord blood. Bone Marrow Transplantation. 17 (2), 169-178 (1996).
  9. Nimgaonkar, M. T., et al. A unique population of CD34+ cells in cord blood. Stem Cells. 13 (2), 158-166 (1995).
  10. Hordyjewska, A., Popiolek, L., Horecka, A. Characteristics of hematopoietic stem cells of umbilical cord blood. Cytotechnology. 67 (3), 387-396 (2015).
  11. Bapat, A., et al. Myeloid Disease Mutations of Splicing Factor SRSF2 Cause G2-M Arrest and Skewed Differentiation of Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells. Stem Cells. 36, 1-13 (2018).
  12. Yip, B. H., et al. The U2AF1S34F mutation induces lineage-specific splicing alterations in myelodysplastic syndromes. Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2206-2221 (2017).
  13. Yoo, E. S., et al. Myeloid differentiation of human cord blood CD34+ cells during ex vivo expansion using thrombopoietin, flt3-ligand and/or granulocyte-colony stimulating factor. British Journal of Haematology. 105 (4), 1034-1040 (1999).
  14. Hao, Q. L., Smogorzewska, E. M., Barsky, L. W., Crooks, G. M. In vitro identification of single CD34+CD38- cells with both lymphoid and myeloid potential. Blood. 91 (11), 4145-4151 (1998).
  15. Moretta, F., et al. The generation of human innate lymphoid cells is influenced by the source of hematopoietic stem cells and by the use of G-CSF. European Journal of Immunology. 46 (5), 1271-1278 (2016).
  16. Sanz, E., et al. Ordering human CD34+CD10-CD19+ pre/pro-B-cell and CD19- common lymphoid progenitor stages in two pro-B-cell development pathways. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5925-5930 (2010).
  17. Egeland, T., et al. Myeloid differentiation of purified CD34+ cells after stimulation with recombinant human granulocyte-monocyte colony-stimulating factor (CSF), granulocyte-CSF, and interleukin-3. Blood. 78 (12), 3192-3199 (1991).
  18. Ogawa, M. Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells. Blood. 81 (11), 2844-2853 (1993).
  19. Perdomo, J., Yan, F., Leung, H. H. L., Chong, B. H. Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells. Journal of Visualized Experiments. (130), e56420 (2017).
  20. Palii, C. G., Pasha, R., Brand, M. Lentiviral-mediated knockdown during ex vivo erythropoiesis of human hematopoietic stem cells. Journal of Visualized Experiments. (53), e2813 (2011).
  21. Davies, C., et al. Silencing of ASXL1 impairs the granulomonocytic lineage potential of human CD34(+) progenitor cells. British Journal of Haematology. 160 (6), 842-850 (2013).
  22. Caceres, G., et al. TP53 suppression promotes erythropoiesis in del(5q) MDS, suggesting a targeted therapeutic strategy in lenalidomide-resistant patients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16127-16132 (2013).
  23. Shi, H., et al. ASXL1 plays an important role in erythropoiesis. Scientific Reports. 6, 28789 (2016).
  24. Mazumdar, C., et al. Leukemia-Associated Cohesin Mutants Dominantly Enforce Stem Cell Programs and Impair Human Hematopoietic Progenitor Differentiation. Cell Stem Cell. 17 (6), 675-688 (2015).
  25. Chung, K. Y., et al. Enforced expression of an Flt3 internal tandem duplication in human CD34+ cells confers properties of self-renewal and enhanced erythropoiesis. Blood. 105 (1), 77-84 (2005).
  26. Ambrosini, P., et al. IL-1beta inhibits ILC3 while favoring NK-cell maturation of umbilical cord blood CD34(+) precursors. European Journal of Immunology. 45 (7), 2061-2071 (2015).
  27. Batard, P., et al. TGF-(beta)1 maintains hematopoietic immaturity by a reversible negative control of cell cycle and induces CD34 antigen up-modulation. Journal of Cell Science. 113, 383-390 (2000).
  28. Huang, N., Lou, M., Liu, H., Avila, C., Ma, Y. Identification of a potent small molecule capable of regulating polyploidization, megakaryocyte maturation, and platelet production. Journal of Hematology & Oncology. 9 (1), 136 (2016).

Play Video

Cite This Article
Bapat, A., Keita, N., Sharma, S. Pan-myeloid Differentiation of Human Cord Blood Derived CD34+ Hematopoietic Stem and Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (150), e59836, doi:10.3791/59836 (2019).

View Video